胡彥麗

（臨洮縣人民醫(yī)院，甘肅定西 730500）

20世紀(jì)末期，美國(guó)著名科學(xué)家Lo等人在孕婦的外周血及羊水中發(fā)現(xiàn)了胎兒來(lái)源的DNA[1]，同時(shí)由于基因工程的基本實(shí)現(xiàn)，使得借助孕婦外周血及羊水中胎兒來(lái)源的DNA片段來(lái)對(duì)胎兒進(jìn)行生物信息分析成為了可能，在這種情況下，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[2-7]。和其他類(lèi)型的方法相比，該種方法完全無(wú)創(chuàng)，切實(shí)減輕了孕婦的痛苦，同時(shí)其準(zhǔn)確率和靈敏度較高，因此在臨床上得到了越來(lái)越多產(chǎn)科專(zhuān)業(yè)醫(yī)師的認(rèn)可。

對(duì)于新生兒來(lái)說(shuō)，以染色體非整倍為代表的染色體異常是其出現(xiàn)缺陷的最主要原因，其中以21-三體綜合征（唐氏綜合征）為代表，因此做好產(chǎn)前篩查是保證優(yōu)生優(yōu)育、提升國(guó)民綜合素質(zhì)的重要措施[8]。一直以來(lái)，在進(jìn)行胎兒染色體異常的篩查和診斷是通過(guò)一篩查、二有創(chuàng)、三分析的步驟來(lái)進(jìn)行的，按該流程進(jìn)行檢查，不僅需要花費(fèi)大量的時(shí)間和金錢(qián)，同時(shí)其中的有創(chuàng)檢查也會(huì)造成孕婦的痛苦，增加宮腔感染甚至流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前，我國(guó)老齡化危機(jī)初現(xiàn)，政府鼓動(dòng)群眾生二胎，“二孩政策”的提出使得醫(yī)院婦產(chǎn)科接收超過(guò)30歲的高齡產(chǎn)婦屢見(jiàn)不鮮，胎兒染色體異常篩查診斷的工作量也隨之增加[9]。另外，當(dāng)前人們?cè)絹?lái)越重視醫(yī)學(xué)人文關(guān)懷，因此，尋找安全、操作簡(jiǎn)單、痛苦小甚至無(wú)痛的新型產(chǎn)前篩查診斷技術(shù)迫在眉睫。有學(xué)者提出了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)在胎兒異常染色體篩查方面的可行性，我院也開(kāi)展了相應(yīng)的研究?，F(xiàn)將本次研究結(jié)果匯報(bào)如下。

一、資料與方法

（一）一般資料

本次研究選擇2018年1月至2020年1月我院因無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)結(jié)果異常并進(jìn)行產(chǎn)前診斷的單胎妊娠孕婦共計(jì)200例作為研究對(duì)象，排除研究對(duì)象本身染色體異常，所有研究對(duì)象的年齡范圍在23～41歲之間，平均年齡為29.37±4.48歲，孕周范圍為19～35周，平均孕周為20.7±4.1周。所有的研究對(duì)象在本次研究中均進(jìn)行了羊膜腔穿刺術(shù)。

（二）納入排除標(biāo)準(zhǔn)

研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：1.孕婦無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查結(jié)果異常；2.唐氏篩查提示高風(fēng)險(xiǎn)；3.孕婦的年齡超過(guò)35周歲；4.既往有生育染色體異?；純旱牟∈罚?.配偶存在染色體結(jié)構(gòu)異常；6.超聲檢查結(jié)果顯示軟指標(biāo)異常。

研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)：1.曾有先兆流產(chǎn)病史；2.在進(jìn)行本次研究前連續(xù)兩次檢測(cè)體溫超過(guò)37.3℃；3.孕婦存在凝血功能障礙，穿刺操作可能造成出血；4.存在盆腔感染。

（三）研究方法

在本次研究中，對(duì)接受無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)結(jié)果提示染色體異常的300例孕婦進(jìn)行羊水染色體核型分析以及染色體陣列分析。

第一，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢查。在進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢查時(shí)，首先采用無(wú)菌采血的方法來(lái)對(duì)孕婦靜脈血進(jìn)行采集，并通過(guò)分離血漿提取胎兒的游離DNA。對(duì)采取到的DNA樣本，采用末端修復(fù)、PCR培養(yǎng)以及純化等方法來(lái)建立一個(gè)完善的待檢測(cè)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。在進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，采用的是IonTorrent測(cè)序平臺(tái)開(kāi)展和進(jìn)行的，將獲取的DNA數(shù)據(jù)和正常人類(lèi)的基因組參考序列進(jìn)行對(duì)比，得到每個(gè)樣本的Z值，進(jìn)而來(lái)對(duì)胎兒是否罹患染色體疾病以及罹患染色體疾病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。

第二，羊水染色體核型分析。進(jìn)行羊水染色體的核型分析可以通過(guò)培養(yǎng)瓶法、核型分析法等方法來(lái)完成。培養(yǎng)瓶法是指對(duì)送檢的羊水標(biāo)本進(jìn)行離心，將上清液剔除，然后將沉渣放置于兩瓶容量為5ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，其內(nèi)裝有培養(yǎng)液，將其置于37.5℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期7天的培養(yǎng)，記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并進(jìn)行細(xì)胞傳代換液，配置觀察玻片，觀察并記錄其G顯帶。而核型分析則是根據(jù)ISCN2016作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)兩個(gè)培養(yǎng)瓶中20個(gè)及以上的中期分裂象進(jìn)行觀察，并將其分為5個(gè)以上的核型，當(dāng)出現(xiàn)2個(gè)及以上細(xì)胞系的增加時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞的嵌合情況進(jìn)行分析鑒定。

第三，染色體陣列分析。將獲取的研究對(duì)象羊水進(jìn)行標(biāo)本離心，摒棄上清液，提取沉渣，獲取羊水中胎兒的DNA，通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增后對(duì)其進(jìn)行酶切，將酶切后的片段和A-C750K芯片進(jìn)行雜交和洗滌，然后將其置于掃描設(shè)備下，通過(guò)掃描軟件來(lái)獲取片段長(zhǎng)度超過(guò)100kb且探針術(shù)超過(guò)50針的片段進(jìn)行分析。此流程因醫(yī)院無(wú)法獨(dú)立完成，因此該步驟中將所有樣本均送至北京海斯特醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，并由該實(shí)驗(yàn)室操作完成檢測(cè)。

（四）觀察指標(biāo)

本次研究對(duì)300例研究對(duì)象同時(shí)進(jìn)行羊水染色體核心分析以及染色體陣列分析，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的研究對(duì)象，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以及無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)陽(yáng)性病例的比對(duì)，觀察篩查結(jié)果的吻合程度。

二、結(jié)果

（一）無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)異常孕婦羊水染色體核型分析結(jié)果

采用無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)的方法以及羊水染色體核型分析21三體陽(yáng)性的預(yù)測(cè)值超過(guò)80%，18染色體三體陽(yáng)性的預(yù)測(cè)值為65%，13三體陽(yáng)性的預(yù)測(cè)值為29.2%，性染色體異常陽(yáng)性的預(yù)測(cè)值為40.8%，而其他類(lèi)型染色體異常陽(yáng)性的預(yù)測(cè)值為2.8%（表1）。

表1 異常孕婦羊水染色體核型分析顯示異常染色體核型及其預(yù)測(cè)值

（二）無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)檢查微重復(fù)微缺失和染色體微陣列分析結(jié)果

對(duì)于200例研究對(duì)象，在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)結(jié)果異常的孕婦中發(fā)現(xiàn)存在染色體缺失及染色體片段重復(fù)的孕婦共計(jì)31例，借助微陣列分子核型分析技術(shù)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)有8例孕婦存在染色體異常，整體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為25.81%，而這8例染色體異常的孕婦當(dāng)中，其中7例為具有致病性質(zhì)的拷貝數(shù)變異，剩余1例的意義尚不明確。

三、討論

2012年，我國(guó)衛(wèi)健委發(fā)布了《中國(guó)新生兒出生缺陷防治報(bào)告》，報(bào)告指出，現(xiàn)階段我國(guó)每年新增存在先天性缺陷的新生兒數(shù)量約為90萬(wàn)例，發(fā)病率占所有新生兒的5.6%，而在這些缺陷兒當(dāng)中，染色體疾病是主要的組成部分[10-12]。有學(xué)者的報(bào)道指出，染色體異常所致的疾病在胎兒娩出過(guò)程中死亡病例占5%～13%，在早期流產(chǎn)中的比例高達(dá)50%以上，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上不能夠?qū)θ旧w疾病進(jìn)行特異性治療，因此對(duì)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前篩查以及產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷及染色體異常的主要預(yù)防措施[11-13]。

近年來(lái)，隨著基因測(cè)序等技術(shù)的不斷成熟，對(duì)高危染色體異常家庭進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，但是對(duì)于普通居民的應(yīng)用尚沒(méi)有大規(guī)模地開(kāi)展[14-15]。在本次研究中，通過(guò)對(duì)年齡超過(guò)35歲且對(duì)產(chǎn)前診斷存在抵觸情緒的高齡孕婦、唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)群體、唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)以及超聲檢查提示軟指標(biāo)存在異常的孕婦進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查，結(jié)果顯示對(duì)于檢測(cè)出染色體異常具有非常重要的意義。因此，對(duì)于不適合接受有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦，建議其在產(chǎn)檢期間常規(guī)接受無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查不僅能夠在染色體非整倍體篩查中具有較高的準(zhǔn)確性和檢出率，同時(shí)隨著深度測(cè)序技術(shù)的不斷成熟以及無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查（高級(jí)別）的開(kāi)展和普及，一些原本很少見(jiàn)的微缺失微重復(fù)檢測(cè)也開(kāi)始在臨床上廣泛應(yīng)用。有研究表明，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查在篩查21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體以及性染色體時(shí)診斷的準(zhǔn)確率較高，這和本次研究的結(jié)果是一致的。同時(shí)，有學(xué)者的研究指出，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查能顯著提升性染色體異常的檢出率。在基于大規(guī)模平行測(cè)序的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查當(dāng)中，進(jìn)行性染色體異常的檢查是具有較高可行性的。隨著深度測(cè)序的不斷發(fā)展以及人們對(duì)人類(lèi)染色體結(jié)構(gòu)了解的不斷加深，當(dāng)分辨率達(dá)到100KB以后，借助無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查能夠?qū)⒃兄衅诓灰装l(fā)現(xiàn)的染色體核型微小病變也檢測(cè)出來(lái)，尤其是對(duì)于微缺失微重復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)也同樣具有實(shí)用性，但是該種檢測(cè)的靈敏度和特異性并不高。在本次研究中，通過(guò)采用無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查的微缺失微重復(fù)來(lái)對(duì)31例染色體異常的孕婦進(jìn)行染色體微陣列分析，結(jié)果提示共有8例異常的病例，占比為25.81%，其中7例為具有致病性質(zhì)的拷貝數(shù)變異，剩余1例為臨床意義尚不明確的拷貝數(shù)變異，提示該種染色體病變可能是由于家族性遺傳編譯所致，這和以往的研究結(jié)果并不一致。造成這種現(xiàn)象的原因除了家族性變異以外，還和研究樣本、孕婦羊水中提取到胎兒有利DNA的含量、染色體片段、測(cè)序的深度以及檢測(cè)方法等諸多因素均存在關(guān)系。