姜心航 張榮 劉紹能 馬繼征 丁佳媛 劉慧敏 張玲 路迎冬

肝竇毛細(xì)血管化是肝纖維化和肝硬化的基本病理改變,一方面導(dǎo)致肝細(xì)胞與血液物質(zhì)交換障礙,另一方面促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積,加重肝纖維化[1]。因此,抑制肝竇毛細(xì)血管化的發(fā)生,對延緩肝纖維化發(fā)展有重要意義。芪術(shù)顆粒由黃芪、白術(shù)、柴胡、茵陳、丹參、莪術(shù)等藥組成,具有益氣健脾、化瘀通絡(luò)、利濕解毒之功效,是我院治療肝纖維化的有效藥物,臨床應(yīng)用已有30余年。以往實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),該藥對肝纖維化模型大鼠有良好的防治效果[2-3]。本研究建立肝纖維化模型基礎(chǔ)上分離肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,結(jié)合電子顯微鏡技術(shù),從細(xì)胞、分子水平上觀察芪術(shù)顆粒對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)窗孔、表型及其毛細(xì)血管化的影響及機(jī)制,以進(jìn)一步闡明該藥抗纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

70只雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量180～200 g,清潔Ⅱ級,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(中國北京)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。這些大鼠被關(guān)在籠中,在環(huán)境控制室內(nèi)(20±2℃,相對濕度36%)進(jìn)行12小時的光/暗循環(huán),允許自由獲取食物和水,用標(biāo)準(zhǔn)合成飼料喂養(yǎng),所有研究方案均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn),倫理委員會受理編號為:IACUC-GAMH-2020-003。

1.2 藥物

芪術(shù)顆粒(文件號:京藥制字Z20063189)由中國中醫(yī)藥研究院廣安門醫(yī)院制劑室(中國北京)制備并提供,曾被列為國家“九·五”攻關(guān)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號96-906-08-03),后又列為國家”十·五”攻關(guān)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號2001BA701A-24)。芪術(shù)顆粒組成:黃芪15 g、莪術(shù)9 g、白術(shù)15 g、丹參15 g、桃仁10 g、茵陳15 g、郁金10 g、柴胡10 g、北豆根10 g、甘草6 g,臨床用量為每次6 g,每日2次,每日總劑量12 g。動物和人類每千克體重的劑量換算系數(shù)為6.25(參考史新友編輯的《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》),大鼠的劑量為1.25 g/(Kg·d)。

1.3 試劑

四氯化碳(CCl4):分析純,北京化學(xué)試劑公司。CCl4(阿拉丁生物,C112041-500mL);橄欖油(分析純,北京化學(xué)試劑公司)。整合素αVβ3(integrin αVβ3,ITGαVβ3)(Abcam,ab52939);臺盼藍(lán)染色試劑盒(Beyotime,C0011);肝竇內(nèi)皮細(xì)胞1抗體(hepatic sinusoidal endothelial cells antibody,SE-1)試劑(NOVUS,NB110-68095SS);血小板—內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)試劑(Affinity,AF6191);無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,中國)、Masson染色試劑盒(Solaibao,G1340-7,中國北京)、甲苯氨藍(lán)染色溶液(谷歌生物科技,G1032,中國武漢)。

1.4 主要儀器

病理切片機(jī)(徠卡儀器有限公司,RM2016,中國上海),立式光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯,IX71),臺式低速離心機(jī)[中國上海醫(yī)療設(shè)備廠醫(yī)療設(shè)備有限公司(80-2)]、振蕩器[中國上海西部分析儀器廠(WH-2)]、電泳儀(泰農(nóng),EPS300)、酶標(biāo)準(zhǔn)儀(賽默,muLISKANMK3)、4℃離心機(jī)(Eppendorf,離心機(jī)5415R)、掃描電子顯微鏡(日立,SU8010)、FACS流式細(xì)胞儀(美國BD公司C6)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 制備藥物血清 雄性Wistar大鼠50只,分為芪術(shù)顆粒高、中、低三個劑量組及模型組、正常組,每組10只。芪術(shù)顆粒按1.25 g/(Kg·d)為中劑量組,中劑量的2倍劑量為高劑量組,0.5倍劑量為低劑量組;模型組與正常組與三蒸水灌胃。均每天灌胃2次,連續(xù)5次灌胃,末次灌胃后1小時于超凈臺中自心臟采血,收集的血液在4℃冰箱垂直靜置3小時,在4℃離心機(jī)中離心3000 rpm×30分鐘,離心后于超凈臺中無菌條件下分離出血清并于56℃水浴箱滅活血清30分鐘,滅活后用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

1.5.2 大鼠肝纖維化模型構(gòu)建 雄性Wistar大鼠20只,大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)取14只造模,大鼠以3 mL/Kg體重腹腔注射40%四氯化碳(橄欖油稀釋)造模,每周2次,連續(xù)4周,建立肝纖維化模型。另6只大鼠作為正常組,同等條件下飼養(yǎng),不造模。各組均每周稱體重1次,依體重調(diào)整給藥劑量。4周后處死大鼠,各組肝組織進(jìn)行HE和Masson染色,觀察肝組織損傷和肝纖維化情況。對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞胞漿保存完好,細(xì)胞核清晰。CCl4誘導(dǎo)4周后,肝小葉細(xì)胞出現(xiàn)典型的脂肪變性、門脈和小葉炎癥,即小葉細(xì)胞內(nèi)有脂肪空泡、炎性細(xì)胞浸潤、肝小葉內(nèi)有肝小葉細(xì)胞浸潤、肝小葉內(nèi)有肝小葉細(xì)胞浸潤,小葉中央?yún)^(qū)域的細(xì)胞腫脹和脂質(zhì)變性。Masson染色顯示正常大鼠無纖維增生,而模型組有纖維組織增生及纖維間隔形成,提示成功建立了肝纖維化動物模型。

1.5.3 原位分離大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞 成功制作肝纖維化大鼠后,將大鼠麻醉致死,將30G無菌針頭插入門靜脈,切斷下腔靜脈。以5 mL/min的速度注射含有0.5 mm EDTA且不含Ca2+或Mg2+的HBSS 10分鐘。然后以5 mL/min的速率用膠原酶和含有0.02%IV型的Ca2+和Mg2+HBSS注釋10分鐘。灌注結(jié)束時,小心地取出肝臟并轉(zhuǎn)移到含有5%血清的DMEM中,用無菌鑷子撕開肝包膜,使肝實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞流出。收集的細(xì)胞懸浮液以50×g的低速離心10分鐘,收集上清液,沉淀以400×g的速度離心10分鐘,沉淀用完整的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮,并小心地添加到含有50%percoll和25%percoll的離心管中。以900×g的高速離心20分鐘(無剎車)后,在25%percoll和50%percoll之間觀察到明顯的非必需細(xì)胞帶。DMEM培養(yǎng)基重完全懸浮后仔細(xì)吸出,離心沖洗掉percoll液殘留,加入非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸浮液24孔板,20分鐘后置于細(xì)胞培養(yǎng)中,不黏壁細(xì)胞懸浮后含1%離心性血內(nèi)皮生長因子而5%的內(nèi)皮ECM按2×106/mL懸浮接種后在鼠尾膠原包裝中為6孔或96孔板。細(xì)胞在37℃和5%CO2下培養(yǎng)。

1.6 檢測內(nèi)容和方法

1.6.1 分組與處理 正常組:不造模LSECs,加正常不含藥血清;模型組:造模LSECs,加正常不含藥血清;低劑量組:造模LSECs,加中藥低劑量藥物血清;中劑量組:造模LSECs,加中藥中劑量藥物血清;高劑量組:造模LESCs,加中藥高劑量藥物血清;血清添加量為10%,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),貼壁后換液,培養(yǎng)48小時后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù) 當(dāng)細(xì)胞生長到覆蓋培養(yǎng)瓶80%或以上時,丟棄培養(yǎng)液并用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗細(xì)胞一次。用0.25%胰蛋白酶消化,加入抗兔CD31和抗鼠SE-1,4℃孵育過夜,離心,PBS沖洗,加入二抗,流式細(xì)胞儀檢測PE-CD31和FITC-SE-1的表達(dá)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6.3 掃描電鏡觀察LSECs窗孔 貼壁于蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)處理完成后棄培養(yǎng)基,用PBS輕輕漂洗后,棄PBS加電鏡固定液室溫固定2小時,再轉(zhuǎn)移至4°保存。鋨酸后固定,梯度脫水,臨界點(diǎn)干燥,將樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上,在離子濺射儀樣品臺上進(jìn)行噴金30秒左右,掃描電子顯微鏡下觀察LSECs窗孔。

1.6.4 Western Blot檢測 CD31、SE-1、大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)、ITGαVβ3、黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、磷酸化黏著斑激酶(phosphorylation focal adhesion kinase,p-FAK)及MAPK的蛋白表達(dá),收集的細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑的裂解液(完整,羅氏)(50 mM的Tris-Cl,pH7.4,1 mM的EDTA pH 8.0,250 mM的NaCl和1%Triton-X)裂解。使用BCA法(Beyotime P0011)測量蛋白質(zhì)裂解物濃度。將10μg細(xì)胞裂解液與5倍樣品緩沖液(15 g的SDS、16.6 mL的b-巰基乙醇、15.6 mL 2MTris pH6.8、57.5 g甘油)混合后,將樣品裝入10%聚丙烯酰胺凝膠中,SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含有0.1%Tween的4%牛奶封閉后,添加以下抗體并在4℃下培養(yǎng)過夜:SE-1抗體、CD31抗體、aβ3抗體、FAK抗體、p-FAK抗體、MAPK抗體、p-MAP抗體、GAPDH抗體。用含有0.1%Tween的PBS溶液清洗膜3次后,添加含有0.1%吐溫和HRP二級抗體(Abcam,ab6721)的4%牛奶,并在室溫下培養(yǎng)2小時。取下膜,將ECL顯影液(Bio-Rad no.170-5060)逐滴添加到膜中,并將其放入GelDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad)中拍照。蛋白表達(dá)水平用內(nèi)部參考蛋白GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。ImageJ v1.8.0軟件進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用spss 18.0軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布,方差齊,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測CD31和SE-1的表達(dá)率

觀察CD31與SE-1的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)對各組大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的CD31陽性細(xì)胞比例和SE-1陽性細(xì)胞比例進(jìn)行了檢測,從結(jié)果可以看出,對照組和肝纖維化組LSECs的CD31、SE-1陽性細(xì)胞比例均在90%以上。與對照組相比,肝纖維化LSECs組的CD31陽性細(xì)胞比例和SE-1陽性細(xì)胞比例均顯著升高(P＜0.05)(見圖1、表1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定LSEC

表1 各組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測CD31與SE-1表達(dá)結(jié)果(±s,%)

表1 各組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測CD31與SE-1表達(dá)結(jié)果(±s,%)

注:與正常組比較a P＜0.05。

CD31 SE-1對照組組別 n 3 93.96±0.40 93.70±0.36模型組 3 95.40±0.70a 95.53±0.90 a

2.2 芪術(shù)顆粒對LSECs開窗的影響

掃描電鏡下可清晰觀察到LSECs的窗孔,正常組窗孔數(shù)多,而且整齊,模型組窗孔數(shù)少而稀疏,經(jīng)藥物血清處理后,芪術(shù)顆粒組有所恢復(fù),尤以大劑量組明顯(見圖2)。

圖2 LSECs掃描電鏡圖(50μm)

2.3 芪術(shù)顆粒對LSECs表型的影響

CD31和SE-1是常用的血管內(nèi)皮標(biāo)志物,在正常肝臟中很少表達(dá)。然而,這些指標(biāo)在肝竇毛細(xì)血管化后肝纖維化的表達(dá)增加。Western Blot檢測各組竇內(nèi)皮細(xì)胞CD31和SE-1的表達(dá)。結(jié)果表明,CCl4組竇內(nèi)皮細(xì)胞CD31和SE-1的表達(dá)明顯高于正常組。芪術(shù)顆粒治療后肝竇內(nèi)皮細(xì)胞CD31和SE-1表達(dá)明顯降低(P＜0.05),結(jié)果表明,芪術(shù)顆?？梢种聘卫w維化大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞CD31和SE-1的表達(dá)(圖3、表2)。

表2 各組細(xì)胞CD31與SE-1表達(dá)結(jié)果(±s)

表2 各組細(xì)胞CD31與SE-1表達(dá)結(jié)果(±s)

注:與正常組比較a P＜0.05,與模型組比較b P＜0.05。

組別 n CD31 SE-1正常組3 0.10±0.01 0.13±0.01模型組 3 0.57±0.02a 0.52±0.03a芪術(shù)低劑量組 3 0.50±0.02ab 0.37±0.02ab芪術(shù)中劑量組 3 0.45±0.03ab 0.28±0.02ab芪術(shù)高劑量組 3 0.35±0.02ab 0.20±0.03 ab

圖3 各組LSEC中SE-1和CD31的表達(dá)

2.4 芪術(shù)顆粒對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞整合素αVβ3-FAKRas/MAPK信號通路的影響

與正常組相比,模型組LSECs整合素αⅤβ3蛋白水平顯著升高(P＜0.05),FAK、MAPK蛋白表達(dá)水平均升高(P＜0.05),提示整合素αⅤβ3、FAK、MAPK蛋白在LSECs中的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。與模型組相比,低、中、高劑量均能抑制整合素αⅤβ3、FAK、MAPK蛋白的表達(dá),同時能夠抑制p-FAK和p-MAPK的表達(dá)(P＜0.05),并表現(xiàn)為一定的劑量依賴關(guān)系(見圖4、5,表3)。

表3 芪術(shù)顆粒對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞整合素各蛋白表達(dá)結(jié)果(±s)

表3 芪術(shù)顆粒對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞整合素各蛋白表達(dá)結(jié)果(±s)

注:與正常組比較a P＜0.05,與模型組比較b P＜0.05。

組別 n aVβ3 MAPK FAK Ras p-MAPK p-FAK正常組 3 0.13±0.02 0.65±0.01 0.84±0.05 0.16±0.03 0.20±0.03 0.09±0.03模型組 3 0.57±0.05a 0.74±0.02 0.89±0.04 0.17±0.02 0.80±0.04a 0.66±0.06a芪術(shù)低劑量組 3 0.35±0.02ab 0.80±0.10 0.80±0.04b 0.17±0.03 0.53±0.03ab 0.48±0.05ab芪術(shù)中劑量組 3 0.26±0.02ab 0.82±0.14a 1.02±0.04ab 0.17±0.01 0.46±0.06ab 0.31±0.01ab芪術(shù)高劑量組 3 0.17±0.01b 0.67±0.02 0.78±0.01b 0.17±0.02 0.41±0.02ab 0.25±0.06 ab

圖4 芪術(shù)顆粒對p-MAPK與p-FAK蛋白表達(dá)情況的影響

圖5 芪術(shù)顆粒對整合素αⅤβ3、FAK、MAPK蛋白表達(dá)情況的影響

3 討論

肝臟復(fù)雜的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)由LSECs排列而成,正常LSECs上無隔膜的窗孔,內(nèi)皮下無基底膜,有利于肝竇內(nèi)物質(zhì)交換,其中窗孔是肝細(xì)胞與肝竇血液間物質(zhì)交流的重要通道[4]。慢性肝病中,LSECs失窗孔,內(nèi)皮下出現(xiàn)基底膜,形成類似連續(xù)性毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu),這一過程稱為肝竇毛細(xì)血管化[5]。肝竇毛細(xì)血管化是與肝纖維化和肝硬化相關(guān)的一種基本病理變化[6-7]。肝竇毛細(xì)血管化的形成導(dǎo)致肝纖維化中LSECs窗孔減少,窗孔直徑變小甚至消失,物質(zhì)交換受阻,出現(xiàn)肝細(xì)胞外基質(zhì)沉積、肝臟微循環(huán)障礙等一系列病變,促進(jìn)肝纖維化、肝硬化的發(fā)生、發(fā)展[8]。除了特異的結(jié)構(gòu)特征外,LSECs亦具有獨(dú)特的表型。大鼠血竇SE-1是1993年Ohmura等發(fā)現(xiàn)的能和LSECs特異結(jié)合,而不和其他內(nèi)皮細(xì)胞或非內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合[9]。SE-1是大鼠LSECs的特異性標(biāo)志物,已經(jīng)成為鑒定大鼠LSEC最可靠的標(biāo)記抗體[10]。正常肝組織LSECs很少表達(dá)CD31,而肝纖維化肝竇毛細(xì)血管化時,LSECs上調(diào)CD31等常見的血管內(nèi)皮表面標(biāo)志物,其表型發(fā)生變化。因此,有人提出將CD31的表達(dá)可作為LSECs表型變化的表面標(biāo)志[11]。本實(shí)驗(yàn)顯示造模后,與正常對照組相比,CD31、SE-1在肝纖維化LSECs中的表達(dá)明顯增加,與上述研究一致。經(jīng)芪術(shù)顆粒含藥血清處理后,肝纖維化LSECs表面的CD31、SE-1表達(dá)量均在一定程度下降,并且以高劑量組最為明顯,提示芪術(shù)顆粒可改變LSECs細(xì)胞表型,從而增強(qiáng)了纖維化的消退,從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

整合素ανβ3在正常肝組織中很少表達(dá),但在血管生成過程中其表達(dá)上調(diào)。最近的研究表明,整合素ανβ3的上調(diào)是血管重建的關(guān)鍵受體分子,也是血管生成的常見生物標(biāo)記物[12-13]。在大鼠纖維化模型中發(fā)現(xiàn)整合素ανβ3表達(dá)與肝纖維化進(jìn)展一致,隨著肝纖維化的加重,CD31表達(dá)增加,提示肝纖維化進(jìn)展中整合素ανβ3表達(dá)水平增加與血管新生有關(guān),并參與間質(zhì)重建。研究表明,整合素ανβ3表達(dá)水平隨肝纖維化發(fā)展而升高[14]。FAK是一種重要的整合素相關(guān)酪氨酸激酶信號蛋白。在肝纖維化過程中,LSEC中整合素水平升高,FAK是整合素信號通路中的一個重要細(xì)胞因子,通過調(diào)節(jié)下游Ras、MAPK信號通路參與血管生成,并在促進(jìn)纖維化中發(fā)揮作用,而抑制FAK可起到抗纖維化治療作用[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,整合素ανβ3蛋白可參與介導(dǎo)LSECs表面CD31、SE-1蛋白的表達(dá),對LSECs窗孔進(jìn)行調(diào)節(jié),其抗纖維化作用可能與其調(diào)節(jié)整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號通路有關(guān)。

在以往的臨床中,我們發(fā)現(xiàn)慢性肝病-肝纖維化-肝硬化這一動態(tài)過程與氣滯-入絡(luò)-血瘀動態(tài)變化非常相似,故可按絡(luò)脈理論認(rèn)識肝纖維化[16-17]。亦有學(xué)者認(rèn)為肝纖維病機(jī)主要為正虛血瘀,輕者在氣,重者入血入絡(luò)[18]。由此提出肝纖維化的病機(jī)關(guān)鍵是在毒損肝絡(luò)的基礎(chǔ)上形成”毒瘀肝絡(luò)”。芪術(shù)顆粒由黃芪、莪術(shù)、白術(shù)、柴胡、茵陳、丹參、桃仁等藥組成,方中黃芪有益氣補(bǔ)虛之功,為補(bǔ)氣要藥,《本草備要》言:“黃芪能溫三焦,壯脾胃,生血生肌?！陛g(shù)有破血行氣,消積止痛之功,取其破血之力以消散肝中之瘀結(jié),如《本草經(jīng)疏》言:“主積聚諸氣,為最靈之藥。”兩藥合用乃氣血同治,扶正祛瘀,攻補(bǔ)兼施。白術(shù)健脾以助黃芪益氣;丹參、桃仁助莪術(shù)活血化瘀。茵陳等清熱利濕解毒,柴胡等疏肝解郁,理氣通絡(luò)。本方具有益氣健脾、化瘀通絡(luò)、利濕解毒之功效,有較好的抗肝纖維化的作用。芪術(shù)顆粒含藥血清可通過減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠LSECc失窗孔,使窗孔孔徑、數(shù)量發(fā)生變化,使其通透性得到改善,同時可通過改變LSECs表型及減少毛細(xì)血管的增值以減輕肝竇毛細(xì)血管化,其機(jī)制與其調(diào)控整合素αⅤβ3-FAK-Ras/MAPK信號通路有關(guān)。

本研究從絡(luò)病理論認(rèn)識肝纖維化,從肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及信號通路進(jìn)行研究,將中醫(yī)藥治療與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、信號通路相聯(lián)系,從分子水平上深化了中醫(yī)絡(luò)病理論的研究基礎(chǔ)。但芪術(shù)顆粒是否調(diào)控其他信號通路,是否調(diào)控該信號通路上的其他分子仍需進(jìn)一步研究。