孟召蓮 王振云 高燕

(濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 271100；2中醫(yī)內(nèi)科；3內(nèi)分泌科)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具侵略性的腫瘤之一。盡管目前包括外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法在內(nèi)的治療策略已取得進(jìn)展，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，膠質(zhì)瘤患者的治療效果仍不理想〔1〕。尋找有效抑制膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的藥物一直是臨床研究的重要課題。天葵子為毛茛科植物天葵的塊狀根莖，主要含有生物堿、香豆精類、內(nèi)酯等化學(xué)成分，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利水通淋、敗毒抗癌等作用〔2，3〕。目前，以天葵子為主要成分的中藥復(fù)方制劑已廣泛用于食管癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的輔助治療〔4，5〕。既往研究證實(shí)，生物堿是天葵子發(fā)揮抗腫瘤作用的有效成分，然而天葵子生物堿在膠質(zhì)瘤中是否具有抗腫瘤作用尚不清楚。本研究通過觀察天葵子生物堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，探討其潛在的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；小干擾RNA(si-RNA)購于南京金斯瑞生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購于上海七海復(fù)泰生物科技公司；密理博Transwell小室購于北京優(yōu)尼生物科技有限公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix Ⅱ購于大連TAKARA生物技術(shù)公司；細(xì)胞裂解緩沖液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Ki67兔單克隆抗體、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗體、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)兔多克隆抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG二級(jí)抗體購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) U251細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80%融合時(shí)加入胰蛋白酶消化，按照1∶3比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.2天葵子生物堿部位的制備 參考關(guān)頻等〔6〕文獻(xiàn)方法獲得天葵子生物堿部位，步驟如下：取30 kg天葵子，95%乙醇煮沸溫浸12 h，70%乙醇煮沸溫浸12 h，重復(fù)1次，減壓回收溶劑成流浸膏，得到天葵子乙醇提取物(CT)。用適量水稀釋CT，離心獲得上清液。將上清液上大孔樹脂，分別用水、50%乙醇和95%乙醇洗脫，獲得95%乙醇洗脫物。將洗脫物溶于無水乙醇，過濾除去濾除不溶部分，將得到的洗脫物氧化鋁柱，再次用95%乙醇洗脫，濃縮干燥后即為天葵子生物堿部位。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將對(duì)數(shù)期U251細(xì)胞接種96孔板，細(xì)胞貼壁后用天葵子生物堿終濃度分別為0、1、10、100 ng/L的DMEM培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24 h，依次記為對(duì)照組、天葵子-L組、天葵子-M組和天葵子-H組。為證實(shí)天葵子的抗腫瘤作用與調(diào)控PRKAG2-AS1表達(dá)有關(guān)，利用Lipofectamine2000將si-NC、si-PRKAG2-AS1轉(zhuǎn)染融合度為50%的U251細(xì)胞，48 h后用含100 ng/L天葵子生物堿的DMEM培養(yǎng)基再孵育細(xì)胞24 h，依次記為天葵子-H+si-NC組、天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力 每組取2×103個(gè)細(xì)胞(100 μl)接種到6孔板中，細(xì)胞貼壁后，向各孔內(nèi)添加10 μl的CCK-8溶液，孵育2 h后，酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=A對(duì)照組/A實(shí)驗(yàn)組。

1.2.5集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆能力 每組取5×102個(gè)細(xì)胞(2 ml)接種到96孔板中，米字型晃動(dòng)平板使細(xì)胞分散均勻。約培養(yǎng)14 d時(shí)，用甲醇固定集落，用0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)算大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲 采用孔徑為8 μm的Transwell小室分析U251細(xì)胞的遷移和侵襲能力。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)取50 μl的基質(zhì)膠預(yù)先包被Transwell上室膜備用。將室放置在24孔板中，下室加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；收獲不同處理組U251細(xì)胞，取200 μl細(xì)胞懸液(不含胎牛血清，細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè))加入到上室中。再培養(yǎng)24 h，棉簽去除上室膜基質(zhì)膠和未侵襲細(xì)胞，隨后用甲醇固定附著在Transwel底部膜的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，以均值表示各組侵襲細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測PRKAG2-AS1表達(dá) 收獲不同處理組U251細(xì)胞，Triozl試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外線吸收法進(jìn)行定量。PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix Ⅱ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算PRKAG2-AS1的相對(duì)表達(dá)量。PRKAG2-AS1引物上游5′-CTGGGTTCATCAAGGTTTGC-3′，下游5′-GAAGACCCAGAAGTCCCACA-3′。GAPDH引物上游5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.8Western印跡檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解緩沖液裂解各組細(xì)胞，收集上清液，紫外線吸收法進(jìn)行蛋白定量。通過十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離20 mg蛋白樣品，并利用濕法轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室溫下用含5%脫脂牛奶緩沖液封閉膜4 h，然后與Ki67抗體(1∶1 500)、E-cadherin抗體(1：1 000)、N-cadherin抗體(1∶500)4℃孵育過夜。室溫下用二級(jí)抗體(1∶1 000)孵育膜4 h。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量(內(nèi)參為GAPDH)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1天葵子對(duì)U251增殖的影響 與對(duì)照組比較，天葵子-L組U251細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H組間上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2天葵子對(duì)U251遷移侵襲的影響 與對(duì)照組比較，天葵子-L組U251細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)無顯著變化(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H組間上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3天葵子對(duì)U251中PRKAG2-AS1表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，天葵子-L組U251細(xì)胞PRKAG2-AS1表達(dá)無顯著變化(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細(xì)胞PRKAG2-AS1表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H組間PRKAG2-AS1表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組U251細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)、PRKAG2-AS1表達(dá)比較

2.4干擾PRKAG2-AS1對(duì)天葵子作用的U251增殖的影響 與天葵子-H+si-NC組比較，天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組U251細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)顯著升高(P<0.001)。見表2。

表2 干擾PRKAG2-AS1對(duì)天葵子作用的U251細(xì)胞 存活率和克隆形成數(shù)的影響

2.5干擾PRKAG2-AS1對(duì)天葵子作用的U251遷移侵襲的影響 與天葵子-H+si-NC組比較，天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組U251細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.001)。見表3。

表3 干擾PRKAG2-AS1對(duì)天葵子作用的U251遷移 侵襲的影響個(gè))

2.6各個(gè)處理組U251中蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，天葵子-L組U251細(xì)胞Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與天葵子-L組比較，天葵子-M、天葵子-H組U251細(xì)胞Ki67和N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，且天葵子-L、天葵子-M、天葵子-H三組間上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與天葵子-H、天葵子-H+si-NC組比較，天葵子-H+si-PRKAG2-AS組U251細(xì)胞Ki67和N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖1和表4。

1～6：對(duì)照組、天葵子-L組、天葵子-M組、天葵子-H組、天葵子-H+si-NC組、天葵子-H+si-PRKAG2-AS1組圖1 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

表4 Western檢測各組細(xì)胞處理U251中蛋白的表達(dá)

3 討 論

膠質(zhì)瘤具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率特點(diǎn)。至今膠質(zhì)瘤仍然難以治愈，平均生存時(shí)間僅為1年左右〔7〕。本研究從天葵子乙醇提取物對(duì)細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響和蛋白表達(dá)等多方面探討了天葵子的抗腫瘤作用。Ki67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)，是檢測癌細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)記〔8，9〕。本研究顯示，中、高劑量天葵子生物堿可顯著抑制U251細(xì)胞存活率和克隆形成，抑制Ki67蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴效應(yīng)。與本研究結(jié)果類似，前人研究顯示天葵子生物堿部位對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402、肺癌細(xì)胞A-549、小鼠移植性S180肉瘤均有抑制生長作用〔6，10〕。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟。通過EMT，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和黏附能力，轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而獲得侵襲或轉(zhuǎn)移性表型，抑制EMT可降低細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力〔11，12〕。本研究結(jié)果提示，天葵子生物堿可顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，在膠質(zhì)瘤中具有抗腫瘤作用。長的非編碼RNA(lncRNA)是一類缺乏蛋白編碼能力的長度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，其通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲性等惡性行為，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)〔13，14〕。研究顯示，lncRNA PRKAG2-AS1在肝癌、結(jié)腸中表達(dá)降低，PRKAG2-AS1可能通過影響PRKAG2表達(dá)、抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性進(jìn)而在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用〔15，16〕。膠質(zhì)瘤患者血清中PRKAG2-AS1表達(dá)亦顯著降低，PRKAG2-AS1低表達(dá)是膠質(zhì)瘤早期診斷的潛在無創(chuàng)傷性生物標(biāo)志物〔17，18〕。本研究結(jié)果提示天葵子的抗腫瘤作用可能調(diào)控PRKAG2-AS1表達(dá)有關(guān)。通過轉(zhuǎn)染si-PRKAG2-AS1發(fā)現(xiàn)下調(diào)PRKAG2-AS1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)高劑量天葵子生物堿對(duì)U251細(xì)胞存活、克隆、遷移侵襲及Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響，恢復(fù)U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。以上研究表明，天葵子生物堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用可能與上調(diào)PRKAG2-AS1表達(dá)有關(guān)。