馬莉莎 王嶸 柴麗霞

(青海省第五人民醫(yī)院放療科，青海 西寧 810007)

微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中，長度19～25 nt。盡管miRNA不編碼蛋白質(zhì)，但它通過在轉(zhuǎn)錄后水平與特定靶標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)相互作用來降解或抑制翻譯，并調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步參與腫瘤的發(fā)展，包括增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和放療敏感性〔1～3〕。研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤中miRNA的失衡與腫瘤細(xì)胞的放療敏感性密切相關(guān)，例如miR-451a〔4〕。miR-214-3p是miRNA家族成員之一，參與乳腺癌〔5〕、肺癌〔6〕、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤〔7〕等的進(jìn)展。Hsieh等〔8〕報道，miR-214-3p誘導(dǎo)小兒顱內(nèi)非生殖性惡性生殖細(xì)胞腫瘤的順鉑耐藥性的表達(dá)。He等〔9〕發(fā)現(xiàn)，miR-214-3p在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中低表達(dá)，然而其在白血病中的生物學(xué)功能和意義仍有待揭示。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)7是Sir2組蛋白脫乙酰酶家族的成員，在許多生理過程中起作用，包括細(xì)胞代謝、衰老和凋亡〔10〕。急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞暴露于氯法拉濱、氟達(dá)拉濱和白消安藥物組合或克拉屈濱、氟達(dá)拉濱和白消安藥物組合可導(dǎo)致60%～80%的細(xì)胞增殖抑制，SIRT7等蛋白水平的降低，細(xì)胞凋亡激活和應(yīng)激反應(yīng)信號通路、蛋白激酶B(AKT)通路的下調(diào)〔11〕。miR-125a-5p可以靶向調(diào)控SIRT7并進(jìn)一步上調(diào)肺癌細(xì)胞的凋亡，從而增加其對輻射的敏感性，SIRT7過表達(dá)降低了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔12〕。但miR-214-3p的異常表達(dá)是否與白血病放療敏感性有關(guān)，以及miR-214-3p是否通過靶向SIRT7影響白血病細(xì)胞的放療敏感性，目前尚不清楚。因此，本研究考察miR-214-3p對SIRT7的靶向調(diào)控及對白血病細(xì)胞放療敏感性的影響，為更好地了解抗輻射機(jī)制提供了一個新的視角。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 人骨髓基質(zhì)細(xì)胞系HS-5，白血病細(xì)胞系K562、HL-60、OCI-AML3(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen)，SIRT7抗體、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、γ-H2AX抗體、磷酸化(p)-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抗體、p-AKT抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(英國Abcam)，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞HS-5、K562、HL-60、OCI-AML3在含有10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2、飽和濕潤條件下培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，選取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以1×105/孔接種在6孔板中，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑制造商的說明，將miR-214-3p及其陰性對照miR-NC，si-SIRT7及其陰性對照si-NC，anti-miR-214-3p及其陰性對照anti-miR-NC，pcDNA-SIRT7及其陰性對照pcDNA-NC轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3實時定量PCR(qPCR)檢測miR-214-3p和SIRT7 mRNA水平 收集細(xì)胞HS-5、K562、HL-60、OCI-AML3，使用TRIzol試劑提取總RNA。分別使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR。U6或GAPDH用作內(nèi)源性對照，通過2-ΔΔCt標(biāo)準(zhǔn)化和估計miR-214-3p和SIRT7 mRNA的相對表達(dá)。引物序列如下：miR-214-3p正義鏈5'-GCATCCTGCCTCCACATGCAT-3'，反義鏈5'-GCGCTGAGGAATAATAGAGTATGTAT-3'；U6正義鏈5'-TGACTTCCAAGTACCATCGCCA-3'，反義鏈5'-TTGTAGAGGTAGGTGTGCAGCAT-3'；SIRT7正義鏈5'-CAGGGAGTACGTGCGGGTGT-3'，反義鏈5'-TCGGTCGCCGCTTCCCAGTT-3'；GAPDH正義鏈5'-AAGTGAAGCAGGAGGGTGGAA-3'，反義鏈5'-CAGCCTCACCCCATTTGATG-3'。

1.4Western印跡檢測SIRT7、CyclinD1、γ-H2AX、p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞HS-5、K562、HL-60、OCI-AML3，檢測SIRT7蛋白表達(dá)。收集不同處理的細(xì)胞K562，檢測SIRT7、CyclinD1、γ-H2AX、p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)。細(xì)胞在RIPA1640裂解緩沖液中提取總蛋白，通過雙辛可寧酸測定法估算蛋白濃度。將50 μg蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，將膜用5%脫脂牛奶封閉印跡。之后，將膜與SIRT7、CyclinD1、γ-H2AX、p-PI3K、p-AKT和參照β-actin一抗(1∶1 000稀釋)進(jìn)行反應(yīng)，后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。使用ImageJ程序進(jìn)行條帶分析。

1.5MTT檢測白血病細(xì)胞K562增殖 收集細(xì)胞K562，以1×105/孔接種于96孔板中。經(jīng)不同的處理后，加入MTT至終濃度為0.5 mg/ml，并將細(xì)胞在37℃下孵育4 h。加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)搖床震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm下讀取光密度，計算細(xì)胞存活率。

1.6細(xì)胞克隆實驗和單機(jī)多靶模型檢測白血病細(xì)胞K562的放射敏感性 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞K562，使用5個照射劑量點(diǎn)(0、2、4、6、8 Gy)的X射線，以5 Gy/min的劑量率照射細(xì)胞，細(xì)胞與輻射源之間的距離為100 cm。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)板中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆時，甲醇和結(jié)晶紫分別固定、染色30 min。于顯微鏡下記錄大于50的細(xì)胞克隆數(shù)，其中，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)(SF)=照射細(xì)胞的克隆形成率/對照細(xì)胞的克隆形成率×100%。單機(jī)多靶模型通過GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行，擬合細(xì)胞K562的存活曲線，計算放射生物學(xué)參數(shù)平均致死量(D0)、準(zhǔn)閉劑量(Dq)、外推值(N)，得出增敏比(SER)。

1.7生物信息軟件預(yù)測和雙熒光素酶活性檢測miR-214-3p與SIRT7的靶向關(guān)系 用TargetScan預(yù)測miR-214-3p和SIRT7的靶向結(jié)合，雙熒光素酶活性檢測進(jìn)一步證實，即構(gòu)建含有miR-214-3p結(jié)合位點(diǎn)的SIRT7-3'UTR野生型(WT)及突變型(MUT)報告基因載體，在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-214-3p或miR-NC和SIRT7-WT或SIRT7-MUT報告基因載體，轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)制造商的說明，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1白血病細(xì)胞系中miR-214-3p和SIRT7的表達(dá)水平 表1和圖1結(jié)果顯示，與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5比較，白血病細(xì)胞K562、HL-60、OCI-AML3中miR-214-3p表達(dá)量明顯減少，SIRT7 mRNA和SIRT7蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，其中，以K562細(xì)胞的差異最為顯著，因此，后續(xù)研究選取白血病細(xì)胞K562為對象。

表1 白血病細(xì)胞系中miR-214-3p和 SIRT7表達(dá)水平

圖1 Western印跡檢測白血病細(xì)胞系中SIRT7蛋白的表達(dá)

2.2高表達(dá)miR-214-3p對白血病細(xì)胞K562增殖和放射敏感性的影響 表2、表3、表4和圖2結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-214-3p組明顯增加白血病細(xì)胞K562中miR-214-3p的表達(dá)量，顯著降低CyclinD1蛋白水平，并明顯提高γ-H2AX蛋白表達(dá)量，減少細(xì)胞存活率及顯著降低白血病細(xì)胞K562 2、4、6、8 Gy時的存活分?jǐn)?shù)(P<0.05)，細(xì)胞SER為1.348。

表2 高表達(dá)miR-214-3p對白血病細(xì)胞 K562增殖的影響

表3 高表達(dá)miR-214-3p對白血病細(xì)胞 K562放射敏感性的影響

表4 高表達(dá)miR-214-3p對白血病細(xì)胞K562存活分?jǐn)?shù)的影響

圖2 Western印跡檢測白血病細(xì)胞K562中 CyclinD1、γ-H2AX蛋白的表達(dá)

2.3SIRT7低表達(dá)對白血病細(xì)胞K562增殖和放射敏感性的影響 圖3、表5、表6和表7結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-SIRT7組明顯降低白血病細(xì)胞K562內(nèi)SIRT7、CyclinD1的蛋白水平，顯著提高γ-H2AX蛋白表達(dá)量，明顯減少細(xì)胞存活率，并且顯著降低白血病細(xì)胞K562的存活分?jǐn)?shù)(P<0.05)，細(xì)胞SER為1.422。

圖3 SIRT7低表達(dá)對白血病細(xì)胞K562增殖

表5 SIRT7低表達(dá)對白血病細(xì)胞K562增殖的影響

表6 SIRT7低表達(dá)對白血病細(xì)胞K562放射敏感性的影響

表7 SIRT7低表達(dá)對白血病細(xì)胞K562存活分?jǐn)?shù)的影響

2.4miR-214-3p靶向調(diào)控SIRT7的表達(dá) 圖4A的TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-214-3p和SIRT7的3'UTR具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。圖4B和表8、表9結(jié)果顯示，與miR-NC和SIRT7-WT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染比較，miR-214-3p和SIRT7-WT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染明顯降低白血病K562細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)，而miR-NC或miR-214-3p和SIRT7-MUT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對K562細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)；K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-214-3p較轉(zhuǎn)染miR-NC明顯減少SIRT7蛋白表達(dá)量(0.37±0.03 vs 0.92±0.09，P<0.05)，轉(zhuǎn)染anti-miR-214-3p較轉(zhuǎn)染anti-miR-NC顯著提高SIRT7蛋白水平(1.28±0.12 vs 0.42±0.04,P<0.05)。

2.5高表達(dá)SIRT7可以逆轉(zhuǎn)miR-214-3p對白血病細(xì)胞K562增殖和放射敏感性的影響 表9、表10、表11和圖5結(jié)果表明，與miR-214-3p和pcDNA-NC共轉(zhuǎn)染比較，miR-214-3p和pcDNA-SIRT7共轉(zhuǎn)染明顯增加白血病細(xì)胞K562的SIRT7和CyclinD1蛋白表達(dá)量，顯著減少γ-H2AX蛋白表達(dá)量，明顯提高細(xì)胞存活率和細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(P<0.05)，SER為0.683。

A：生物信息軟件預(yù)測miR-214-3p與SIRT7靶向關(guān)系B：Western Blot檢測白血病細(xì)胞K562中SIRT7蛋白表達(dá)量圖4 miR-214-3p靶向SIRT7，調(diào)控SIRT7表達(dá)

表8 miR-NC或miR-214-3p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞 K562后的雙熒光素酶活性檢測

表9 高表達(dá)SIRT7可以逆轉(zhuǎn)miR-214-3p對白血病細(xì)胞K562增殖和放射敏感性的影響

表10 各組白血病細(xì)胞K562轉(zhuǎn)染處理聯(lián)合X射線照射對K562細(xì)胞作用的單擊多靶模型參數(shù)值

表11 高表達(dá)SIRT7可以逆轉(zhuǎn)miR-214-3p對白血病細(xì)胞K562存活分?jǐn)?shù)的影響

1，2：miR-214-3p+pcDNA-NC組，miR-214-3p+pcDNA-SIRT7組圖5 高表達(dá)SIRT7可逆轉(zhuǎn) miR-214-3p對白血病細(xì)胞K562增殖

2.6白血病細(xì)胞K562中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 表12和圖6檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，高表達(dá)miR-214-3p明顯減少K562細(xì)胞的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量(P<0.05)；與miR-214-3p和pcDNA-NC共轉(zhuǎn)染比較，miR-214-3p和pcDNA-SIRT7共轉(zhuǎn)染顯著提高K562細(xì)胞的p-PI3K和p-AKT蛋白水平(P<0.05)。

表12 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

1～4：miR-NC組,miR-214-3p組,miR-214-3p+pcDNA-NC組,miR-214-3p+pcDNA-SIRT7組圖6 Western印跡檢測p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)

3 討 論

白血病是常見的惡性血液病之一，作為一種惡性腫瘤，聯(lián)合化療、靶向治療和造血干細(xì)胞移植是白血病常用的臨床治療方法，其中，聯(lián)合化療是主要的治療方法。隨著放射治療技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)療法與放射療法相結(jié)合已成為在造血干細(xì)胞移植之前進(jìn)行預(yù)處理的重要手段〔13〕。簡單的大劑量化療無法起到清髓作用，并且，由于化療藥物的局限性，很難通過化學(xué)療法清除腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)〔14〕，而放射治療有助于解決這一難題〔15〕。因此，了解對放射療法的抗性機(jī)制和提高治療功效對于發(fā)掘針對白血病的新療法非常重要。一些研究人員已經(jīng)證明，腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)失調(diào)可通過調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)來影響其對放療的敏感性〔2〕。因此，miRNA可能成為克服腫瘤細(xì)胞放療抵抗的先進(jìn)途徑之一。本研究揭示了白血病細(xì)胞系K562、HL-60、OCI-AML3中miR-214-3p表達(dá)水平的變化及miR-214-3p對K562細(xì)胞X射線照射的敏感性。miR-214-3p通過調(diào)節(jié)SIRT7并影響PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑提高了白血病K562細(xì)胞的放療敏感性。本研究證實了miR-214-3p參與白血病細(xì)胞放療敏感性的機(jī)制，為克服白血病細(xì)胞的輻射抵抗提供了一條新途徑。

miRNA通過多種機(jī)制在癌癥中發(fā)揮著重要作用，引起了越來越多的關(guān)注。許多miRNA，作為抑癌基因或原癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程〔16〕，包括白血病〔17，18〕。資料顯示，miR-214-3p在三陰乳腺癌中低表達(dá)，通過靶向ST6GAL1抑制癌細(xì)胞的存活、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔19〕。miR-214-3p在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中下調(diào)，miR-214-3p的過表達(dá)抑制了癌細(xì)胞的遷移和EMT，而其敲低則促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展〔20〕。在結(jié)直腸癌中miR-214-3p低表達(dá)，高表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，miR-214-3p可能是腫瘤抑制因子。He等〔9〕報告指出，急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中的miR-214-3p表達(dá)下調(diào)，然而其在白血病放療敏感性中的作用仍不清楚。本實驗同樣檢測到miR-214-3p在白血病細(xì)胞K562、HL-60、OCI-AML3中的表達(dá)量明顯減少，提示在白血病中，miR-214-3p可能具有抑癌活性。本研究功能試驗結(jié)果說明miR-214-3p可以抑制白血病細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)其放療敏感性。總體而言，這些結(jié)果表明miR-214-3p的高表達(dá)是改善白血病輻射抗性的重要因素之一，并且可能成為調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞放療敏感性的潛在靶標(biāo)。

本實驗結(jié)果還表明，SIRT7是該過程的重要組成部分，其表達(dá)對于miR-214-3p誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞放療敏感性至關(guān)重要。根據(jù)報道，SIRT7在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)〔10〕。SIRT7的敲除通過抑制前列腺癌中的雄激素受體信號傳導(dǎo)，來抑制細(xì)胞的增殖，還可增加前列腺癌細(xì)胞對輻射的敏感性〔21〕。本實驗中，白血病細(xì)胞K562、HL-60、OCI-AML3中SIRT7 mRNA和SIRT7蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，SIRT7低表達(dá)明顯抑制白血病K562細(xì)胞的增殖和CyclinD1蛋白表達(dá)，促進(jìn)磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)表達(dá)，并明顯降低不同劑量X射線照射后K562細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，提示SIRT7低表達(dá)通過抑制白血病細(xì)胞的增殖，來提高放療敏感性，與前人研究〔22〕相符。基于這些發(fā)現(xiàn)，SIRT7抑制似乎是白血病放射治療的潛在增強(qiáng)劑。本研究結(jié)果證實，通過靶向調(diào)節(jié)SIRT7的表達(dá)水平，miR-214-3p可以改變白血病細(xì)胞對放療的敏感性。

PI3K/AKT信號通路參與細(xì)胞生長，增殖和分化，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和結(jié)果中起重要作用，其異常激活是腫瘤抗輻射性的重要機(jī)制〔23〕。PI3K是一種在細(xì)胞內(nèi)具有催化活性的信號蛋白，可由細(xì)胞外細(xì)胞因子、藥物、應(yīng)激和其他因素激活。激活后的PI3K可以促進(jìn)AKT的激活，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖相關(guān)的基因和其他基因的表達(dá)〔24〕。高表達(dá)miR-214-3p明顯降低K562細(xì)胞的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)，而這種抑制作用被高表達(dá)SIRT7所逆轉(zhuǎn)。表明miR-214-3p通過靶向SIRT7，并影響PI3K/AKT信號通路的活性，來介導(dǎo)白血病細(xì)胞的放療敏感性。

總之，miR-214-3p通過抑制白血病細(xì)胞的增殖能力，增強(qiáng)其放療敏感性，機(jī)制與靶向SIRT7調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路有關(guān)。這些結(jié)果可能有助于對白血病或其他顯示miR-214-3p或SIRT7表達(dá)異常的癌癥患者實施個性化治療，從而提高放射治療的效率。并且，這些結(jié)果可能會提供基于miR-214-3p/SIRT7/PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑的潛在治療靶點(diǎn)，以克服腫瘤的輻射抗性。