劉英姿 劉亮

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 1神經(jīng)外科，河北 石家莊 050011；2腫瘤研究所)

腦膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率及病死率較高〔1，2〕，盡管采取了手術(shù)結(jié)合放化療的辦法，腦膠質(zhì)瘤整體治療效果仍較差〔3〕。隨著免疫調(diào)控與腫瘤關(guān)系研究的深入，腦膠質(zhì)瘤的免疫治療逐步得到人們的重視，并成為研究熱點。深入研究腦膠質(zhì)瘤的免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)特點對制定合理的免疫治療策略尤為重要。Toll樣受體(TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的模式識別受體(PRR)，它可通過識別病原相關(guān)的分子模式(PAMP)及某些內(nèi)源性配體引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致固有免疫的激活和炎性介質(zhì)的釋放，并參與人體多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生〔4，5〕。在人類已發(fā)現(xiàn)10種TLRs，其中TLR4與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)〔6～8〕，成為當(dāng)前腫瘤免疫領(lǐng)域一個新的研究熱點。本研究擬研究TLR4基因與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系，為研究人腦膠質(zhì)瘤免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 All-in-OneTMqPCR Primer、H-TLR4-shRNA(1-3)質(zhì)粒(GeneCopoeia， 美國)；LipofectamineTM2000 (Invintrogen， 美國)；高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒 (天根生化科技有限公司，中國)；RNA isolater總RNA extraction reagent、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、qPCR SYBR Green Master mix試劑 (Vazyme，中國)；MEM培養(yǎng)基 (Gibco， 美國)；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(銳博， 中國)；FC-500型流式細(xì)胞儀 (Beckman Coulter公司， 美國)；PCR儀 (Eppendorf，德國)；Mx3000P熒光定量PCR儀 (Agilent， 美國)。

1.2細(xì)胞株 U-87MG細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司，本實驗室傳代培養(yǎng)。接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中(補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100 U/L)，培養(yǎng)器皿置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3TLR4-shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 Gene Copoeia 公司合成干擾質(zhì)粒(Catalog No.：HSH054754-CU6-a，b，c;CSHCTR001-CU6)；Accession No.：NM_003266.3。載體為psi-U6.1，設(shè)計3條干擾TLR4基因的表達(dá)小發(fā)夾RNA(shRNA)，3條shRNA目標(biāo)序列見表1。

1.4shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞沉默TLR4基因及轉(zhuǎn)染效率檢測 取對數(shù)生長期的U-87MG細(xì)胞4×105個/孔接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后待融合度達(dá)到85%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，加轉(zhuǎn)染試劑前用無血清及抗生素的MEM，培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞2遍，每孔加2 ml無胎牛血清及抗生素的MEM培養(yǎng)液，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，室溫放置20 min后加入6孔板中，6 h后換全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染CU6-a、CU6-b、CU6-c，分別定義為TLR4-sh1組、TLR4-sh2組、TLR4-sh3組，轉(zhuǎn)染CU6定義為陰性對照組。同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的空白組及只加脂質(zhì)體的脂質(zhì)體組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞1次，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光，以綠色熒光所占檢測細(xì)胞的百分比代表轉(zhuǎn)染效率，篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒作為后續(xù)實驗用質(zhì)粒。

表1 shRNA 目標(biāo)序列

1.5嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 經(jīng)過實驗驗證，CU6-b質(zhì)粒沉默TLR4表達(dá)效果最佳，因此后續(xù)的siRNA實驗選擇CU6-b質(zhì)粒。U-87MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染CU6-b重組質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒48 h后，將細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液按1∶10比例稀釋，以5×104個/孔細(xì)胞加入6孔板中，向6孔板中加入篩選濃度的嘌呤霉素(600 ng/ml)。未轉(zhuǎn)染的U-87MG細(xì)胞作為對照組。培養(yǎng)14 d，存活的細(xì)胞即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染CU6-b的細(xì)胞命名為U-87MG-Sh，定義為TLR4-sh組，轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的細(xì)胞命名為U-87MG-NC，定義為陰性對照組。U-87MG-Sh 及U-87MG-NC細(xì)胞在含300 ng/ml嘌呤霉素的全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的空白組。

1.6qRT-PCR檢測U-87MG-Sh、U-87MG-NC及U-87MG細(xì)胞中TLR4、核因子(NF)-κB及細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1 mRNA 表達(dá) 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的U-87MG-Sh(TLR4-sh組)、U-87MG-NC(陰性對照組)及U-87MG細(xì)胞(空白組)，冷PBS洗滌2次，加入1 ml RNA isolater試劑，常規(guī)一步法提取總RNA。按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。按照標(biāo)準(zhǔn)的實時定量PCR流程執(zhí)行，采用SYBR-Green Ⅰ作為熒光染料，每個樣品重復(fù)3次。TLR4序列由美國Gene Copoeia公司合成，Catalog number：HQP054754； NF-κB 上游引物5′-CACCCTGACCTTGCCTAT-3′，下游引物5′-CCCAGACTCCACCATTTT-3′；CyclinD1上游引物5′-CTGTCCCACTCCTACGATACGC-3′，下游引物5′-CTTGCCTCAAAGTCCTGCTTG-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CACTACCGTACCTGACACCA-3′，下游引物5′-ATGTCGTTGTCCCACCACCT-3′。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算TLR4(NF-κB或CyclinD1)mRNA的相對表達(dá)量。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的U-87MG-Sh(TLR4-sh組)、U-87MG-NC(陰性對照組)及U-87MG細(xì)胞(空白組)，冷PBS洗滌2次，70%乙醇 4℃固定24 h。PBS 洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，取100 μl細(xì)胞懸液向其中加入1ml碘化丙啶，4℃染色30 min后上流式細(xì)胞儀檢測，用Muticycle AV分析軟件對DNA細(xì)胞周期擬合分析。

1.8利用EdU試劑流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的U-87MG-Sh(TLR4-sh組)、U-87MG-NC(陰性對照組)及U-87MG細(xì)胞(空白組)接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁后，更換含有EdU試劑的EdU培養(yǎng)基(50 μmol/L EdU)，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。常規(guī)收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，350 r/min 5 min離心，去上清，4%多聚甲醛固定20 min， 600 r/min離心 10 min，去上清。2 mg/ml甘氨酸中和5 min，600 r/min離心10 min 去上清，PBS洗滌細(xì)胞，600 r/min離心5 min去上清。加入1 ml 0.5%TritonX-100滲透劑室溫孵育10 min，600 r/min離心10 min，去上清，PBS清洗1次去上清。加入500 μl 1X Apollo?染色反應(yīng)液，充分重懸細(xì)胞，避光、室溫孵育10 min后，600 r/min離心10 min，去上清。3 ml 0.5%TritonX-100滲透劑室溫清洗2次，600 r/min離心10 min吸棄上清，1 ml PBS重懸，立即進(jìn)行流式檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞沉默TLR4基因 U-87MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察， TLR4-sh1組、TLR4-sh2組、TLR4-sh3組及陰性對照組大量的細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光見圖1，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，TLR4-sh1、TLR4-sh2、TLR4-sh3組轉(zhuǎn)染效率分別為〔(33.66±0.40)%、(46.20±0.31)%、(25.49±0.60)%〕，TLR4-sh2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高，后續(xù)實驗選擇CU6-b質(zhì)粒進(jìn)行實驗。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光(×100)

2.2U-87MG穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TLR4-sh細(xì)胞建立及轉(zhuǎn)染效率、TLR4基因表達(dá)檢測 600 ng/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞14 d后，空白組細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染CU6-b質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒的細(xì)胞中有大量細(xì)胞存活。見圖2。存活的細(xì)胞即為篩選出來的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CU6-b質(zhì)粒的細(xì)胞命名為U-87MG-Sh定義為TLR4-sh組，轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒的細(xì)胞命名為U-87MG-NC定義為陰性對照組。TLR4-sh組及陰性對照組的轉(zhuǎn)染率分別為(95.05±0.17)%及(94.75±0.72)%，見圖3。TLR4-sh組細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)水平(0.028 3±0.001 7)顯著低于陰性對照組 (0.163 7±0.023 4)及空白組(0.166 9±0.002 9)細(xì)胞中的表達(dá)水平(P<0.01)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖周期及EdU表達(dá)水平 TLR4-sh組G0/1期細(xì)胞〔(73.37±2.20)%〕顯著高于空白組〔(64.70±2.28)%〕及陰性對照組〔(64.89±0.53)%,P<0.01〕；TLR4-sh組細(xì)胞增殖指數(shù)〔PI,(26.63±2.20)%〕顯著低于空白組〔(35.30±2.28)%〕及陰性對照組〔(35.11±0.53)%〕(P<0.01)，見圖4。TLR4-sh組細(xì)胞內(nèi)EdU表達(dá)水平(19.53±1.05)顯著低于空白組(26.22±1.95)及陰性對照組(26.27±1.86,P<0.01)。見圖5。

圖2 經(jīng)過嘌呤霉素篩選后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染 細(xì)胞綠色熒光(×100)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)

圖4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖周期

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中EdU表達(dá)

2.4RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NF-κB及CyclinD1 mRNA表達(dá)水平 TLR4-sh組細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)水平(0.11±0.01)顯著低于陰性對照組(0.34±0.02)及空白組(0.33±0.01,P<0.01)。TLR4-sh組細(xì)胞CyclinD1 mRNA表達(dá)水平(0.21±0.02)顯著低于陰性對照組(0.42±0.03)及空白組(0.41±0.02,P<0.01)。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤〔9,10〕。盡管采取了手術(shù)結(jié)合放化療等治療，腦膠質(zhì)瘤整體治療效果仍差，高級別的膠質(zhì)瘤患者的平均生存期不足1年。

TLRs是哺乳動物體內(nèi)所具有的Ⅰ型跨膜蛋白，是一類保守的介導(dǎo)固有免疫的跨膜信號傳遞受體家族，是PRR中的一員，參與PAMPs的識別，在識別和抵御各種病原微生物及其產(chǎn)物的過程中發(fā)揮重要作用。雖然TLRs介導(dǎo)固有免疫，但TLRs并非固有免疫系統(tǒng)所特有，TLRs主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，如單核/巨噬細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞等〔11，12〕，也可表達(dá)于一些非免疫細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞〔13，14〕、平滑肌細(xì)胞〔15，16〕及腫瘤細(xì)胞〔17～19〕等。TLRs在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)對于腫瘤發(fā)生及發(fā)展具有重要意義，其中以TLR4最具廣譜性和高表達(dá)性，高表達(dá)的TLR4可促進(jìn)腫瘤生長〔20～22〕，并介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。研究表明，TLR4與腫瘤密切相關(guān)〔23～25〕，但TLR4與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的研究鮮有報道。

NF-κB在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起著關(guān)鍵性作用，研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通過調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔26～28〕。NF-κB是TLR4的下游目標(biāo)受體，TLR4通過MyD88依賴及非依賴兩種信號通路激活下游NF-κB，使之行使其功能。NF-κB可以直接激活CyclinD1，使細(xì)胞通過G1/S檢測點，促進(jìn)細(xì)胞的增殖〔29〕，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。