李哲 柳志寶 孫震 李華蕊

(滄州市中心醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)一科，河北 滄州 061000；2胸外科；3營(yíng)養(yǎng)科)

肺癌是目前臨床上最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率較高，小細(xì)胞肺癌是肺癌的一種，雖僅占肺癌的20%左右，但其惡性程度高，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移〔1〕。雖然，小細(xì)胞肺癌患者對(duì)化療和放療有良好初始反應(yīng)性，然而很多患者化療后很快復(fù)發(fā)，耐藥性是造成化療失敗的主要原因〔2〕。因此，克服小細(xì)胞肺癌的化療耐藥對(duì)臨床治療小細(xì)胞肺癌有重要意義。阿帕替尼是一種口服小分子抗血管生成劑，可抑制腫瘤血管生長(zhǎng)；研究報(bào)道阿帕替尼對(duì)晚期一線或一線以上治療失敗的小細(xì)胞肺癌患者有一定的臨床獲益，安全性可控〔3，4〕，表明阿帕替尼治療小細(xì)胞肺癌有良好效果，提高小細(xì)胞肺癌對(duì)阿帕替尼的敏感性能進(jìn)一步提高其療效。研究表明lncRNA可在轉(zhuǎn)錄中、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)控相關(guān)基因水平的表達(dá)，從而影響小細(xì)胞肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥〔5〕。王亞芳等〔6〕利用高通量lncRNA芯片技術(shù)分別檢測(cè)發(fā)生轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌組織中差異表達(dá)的lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ENST00000415026在發(fā)生轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)；提示ENST00000415026可能參與了小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的惡性表型；但其對(duì)小細(xì)胞肺癌阿帕替尼敏感性的影響及機(jī)制還尚不清楚。研究報(bào)道m(xù)iR-653高表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔7〕。上調(diào)miR-653可抑制膀胱癌的生長(zhǎng)〔8〕，表明上調(diào)miR-653可抑制肺癌及膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。但miR-653對(duì)小細(xì)胞肺癌阿帕替尼敏感性的影響尚不清楚。本研究旨在探討ENST00000415026對(duì)小細(xì)胞肺癌阿帕替尼敏感性的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般臨床資料 收集2018年1月至2020年1月河北省滄州市中心醫(yī)院具有完整資料的26例小細(xì)胞肺癌和癌旁組織標(biāo)本。其經(jīng)病理檢測(cè)為小細(xì)胞肺癌，患者手術(shù)前未進(jìn)行手術(shù)及放化療，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的組織作為癌旁組織，所有患者同意且簽署知情書(shū)。

1.2細(xì)胞與主要試劑 A549細(xì)胞購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；阿帕替尼購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8購(gòu)自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3阿帕替尼耐藥細(xì)胞的培養(yǎng) A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中在37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入阿帕替尼培養(yǎng)，阿帕替尼起始濃度為0.001 μg/ml，刺激48 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，選擇存活細(xì)胞繼續(xù)逐漸增加阿帕替尼濃度(0.010 μg/ml、0.100 μg/ml)進(jìn)行培養(yǎng)，直到最后在1.00 μg/ml阿帕替尼濃度下能穩(wěn)定存活，命名為A549/APA細(xì)胞。分別用0.001 μg/ml、0.010 μg/ml、0.100 μg/ml、1.000 μg/ml阿帕替尼刺激A549和A549/APA細(xì)胞，用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率，進(jìn)一步確定A549/APA細(xì)胞耐藥，以正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞A549/APA，將ENST00000415026干擾表達(dá)載體(si-ENST00000415026)及陰性對(duì)照(si-NC)轉(zhuǎn)染至A549/APA細(xì)胞中，記為si-ENST00000415026組、si-NC組；將si-ENST00000415026分別與miR-653抑制劑(anti-miR-653)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)共轉(zhuǎn)染至A549/APA細(xì)胞中，記為si-ENST00000415026+anti-miR-653組、si-ENST00000415026+anti-miR-NC組。

1.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 選擇不同濃度阿帕替尼刺激的A549和A549/APA細(xì)胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)ENST00000415026和miR-653的表達(dá)水平 提取肺癌組織、癌旁組織及A549、A549/APA和各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后按照熒光定量試劑盒說(shuō)明建立終體積為20 μl PCR體系(2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl無(wú)菌水)；PCR條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct計(jì)算。ENST00000415026和miR-653分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6為內(nèi)參，ENST00000415026上游引物序列：5′-GACAGACCTCCAGCTTCCAG-3′，下游引物序列：5′-TTCAGAAGGACAGCCGAAGT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-653上游引物序列：5′-TTCACTGGAGTTTGTTTCAAT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，離心棄上清；然后重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的80%乙醇，4℃固定過(guò)夜；用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入核糖核酸酶(RNase)A，37℃孵育30 min，加入PI染色液4℃染色15 min，上機(jī)檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光，用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸后分別加入10 μl的Annexin V-FITC和加入5 μl PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ENST00000415026和miR-653的靶向關(guān)系 StarBase預(yù)測(cè)顯示ENST000 00415026與miR-653存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建ENST0 0000415026的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-ENST00000415026和MUT-ENST00000415026，用LipofectamineTM 2000將其分別與miR-NC和miR-653共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10Western印跡檢測(cè)Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行定量。取50 μl蛋白樣品于10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5 %的牛血清蛋白封閉1 h；加入一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達(dá)水平=目的條帶和GAPDH條帶的比值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1APA對(duì)A549和A549/APA細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組相比，當(dāng)阿帕替尼濃度≥0.100 μg/ml時(shí)A549細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，而阿帕替尼濃度為1.000 μg/ml時(shí)A549/APA細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化(P>0.05,表1)；表明A549/APA細(xì)胞對(duì)阿帕替尼耐藥，將其作為肺癌耐阿帕替尼細(xì)胞。

2.2ENST00000415026在肺癌中的表達(dá) 與癌旁組織(0.96±0.11)相比，肺癌組織中ENST0000 0415026表達(dá)水平(3.28±0.24)顯著升高(P<0.05)；與A549細(xì)胞(3.39±0.11)相比，A549/APA細(xì)胞中ENST00000415026表達(dá)水平(4.54±0.14)也顯著升高(P<0.05)。

2.3干擾ENST00000415026對(duì)A549/APA增殖凋亡的影響 與si-NC組相比，si-ENST00000415026組ENST00000415026表達(dá)水平顯著降低，miR-653表達(dá)水平顯著升高，G0-G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，S期細(xì)胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2-M期細(xì)胞所占比例無(wú)顯著變化(P>0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1，表2)。

表1 APA對(duì)A549和A549/APA細(xì)胞 存活率的影響

圖1 干擾ENST00000415026對(duì)A549/APA 凋亡率的影響

表2 干擾ENST00000415026對(duì)A549/APA增殖凋亡的影響

2.4ENST00000415026靶向miR-653 StarBase在線軟件預(yù)測(cè)顯示ENST00000415026與miR-653存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-NC組相比，miR-653組中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ENST00000415026的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染MUT-ENST00000415026的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05),表3。

2.5抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000415026處理A549/APA增殖凋亡的影響 與si-ENST0000 0415026+anti-miR-NC組相比，si-ENST00000415026+anti-miR-653組miR-653、G0-G1期細(xì)胞所占比例顯著降低，S期細(xì)胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2-M期細(xì)胞所占比例無(wú)顯著變化(P>0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，圖3，表4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖3 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000415026處理 A549/APA凋亡的影響

表4 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000415026處理A549/APA增殖凋亡的影響

2.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中Ki67、Caspase-3蛋白表達(dá) 與si-NC組相比，si-ENST00000415026組Ki67表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與si-ENST00000415026+anti-miR-NC組相比，si-ENST00000415026+anti-miR-653組Ki67表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4，表7。

1～4：Si-NC組、si-ENST00000415026組、si-ENST00000415026+anti-miR-NC組、si-ENST00000415026+anti-miR-653組圖4 Ki67、Caspase-3蛋白表達(dá)

表7 各組細(xì)胞中Ki67、Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

小細(xì)胞肺癌惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，進(jìn)展迅速，臨床以化療和放療為主要治療手段，在放化療失敗后缺乏有效治療手段，抗血管生成治療在晚期小細(xì)胞肺癌中表現(xiàn)出一定療效〔9〕；研究表明新型的抗血管生成劑阿帕替尼對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的晚期肺癌有明顯療效，且不良反應(yīng)可控〔10〕。研究表明lncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療藥物的耐藥性與敏感性，研究其在腫瘤中的作用機(jī)制，可為提高化療藥物敏感性提供參考依據(jù)〔11〕。研究表明ENST00000415026在小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)〔6〕；本研究結(jié)果表明ENST00000415026可能與A549細(xì)胞的阿帕替尼耐藥性相關(guān)。Ki67是細(xì)胞核增殖抗原，抑制Ki67可抑制細(xì)胞增殖〔12〕；Caspase-3是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子，Caspase-3高表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔13〕。表明干擾ENST00000415026可抑制A549/APA細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；干擾ENST00000415026可增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)阿帕替尼的敏感性。

研究表明lncRNA可與miRNA相互作用參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔14〕。研究報(bào)道circ-RAD23B可通過(guò)miR-653-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲〔15〕。沉默circ_0004771通過(guò)激活miR-653抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡〔16〕。表明miR-653高表達(dá)可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，干擾ENST00000415026可能通過(guò)上調(diào)miR-653增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌對(duì)阿帕替尼的敏感性。