姚韶華，程雅清，武若楠，臧瑞祥，李新偉，雷于國，劉啟燕，胡國元*

1. 武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205；

2. 湖北裕國菇業(yè)股份有限公司，湖北隨州 441300；

3. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北武漢430070

羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachyman，CMP）的制備多采取從茯苓菌核中提取或從茯苓發(fā)酵液提取的茯苓多糖經(jīng)化學(xué)修飾的方法，本實(shí)驗(yàn)室建立了通過茯苓發(fā)酵直接制備CMP 的方法［1-2］。大量文獻(xiàn)報(bào)道CMP 具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的生態(tài)平衡和減輕結(jié)腸損傷的作用［2-4］。CMP 目前在食品保鮮領(lǐng)域上應(yīng)用還鮮有報(bào)道。

香菇是我國食用菌年產(chǎn)量最大的單品［5］。由于新鮮的香菇采后含有較高的水分，新陳代謝旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)消耗快，易受到機(jī)械傷害，引起子實(shí)體的褐變或腐敗變質(zhì)，影響其藥用和食用價(jià)值，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。目前多糖類生物保鮮劑在香菇保鮮研究領(lǐng)域受到青睞。有研究發(fā)現(xiàn)多糖類保鮮劑涂膜處理香菇后，在貯藏期內(nèi)延緩了香菇營養(yǎng)品質(zhì)的下降，同時(shí)對(duì)香菇體內(nèi)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性起到抑制作用［7-8］。PPO 是果蔬酶促褐變的主要酶類，同樣也是導(dǎo)致香菇褐變的主要酶類，褐變對(duì)香菇的色澤及感官品質(zhì)都有很大的影響，因此在香菇保鮮范疇內(nèi)對(duì)它的研究是相當(dāng)重視［9］。

為提高貯藏期內(nèi)新鮮香菇的商品和食用價(jià)值，延長香菇貨架期，減少經(jīng)濟(jì)損失［10-11］。本研究通過探究CMP 對(duì)香菇體內(nèi)PPO 體外酶活的抑制作用，初步確定CMP 對(duì)香菇保鮮試驗(yàn)的有效性和保鮮試驗(yàn)所用CMP 濃度，通過不同濃度的CMP 處理香菇，研究其對(duì)香菇保鮮效果的影響，找到最佳的CMP 保鮮濃度，并對(duì)CMP 的應(yīng)用提供了一條新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑、儀器

1.1.1 材料與試劑 茯苓菌株Z1 由湖北省中醫(yī)藥研究院王克勤研究員惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保藏。

香菇子實(shí)體（菌種號(hào)為0912）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

3，5-二硝基水楊酸（成都科龍化工試劑廠）；沒食子酸、福林酚、Na2CO3、無水乙醇（天津博迪化工股份有限公司）；葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、無 水乙醇、2，6-二氯靛酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）、苯酚、考馬斯亮藍(lán)G-250（麥克林）。以上試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 紫外分光光度計(jì)：T6 新世紀(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；冰箱：LSC-288G（浙江星星冷鏈集成股份有限公司）；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D（Ⅲ）（河南省予華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9053A（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機(jī)：Multifuge X1R［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；高壓蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；臺(tái)式全溫振蕩培養(yǎng)箱：MQT-60R（上海旻泉儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9080（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香菇預(yù)處理 自湖北省農(nóng)科院采摘的香菇，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分揀，去除田間熱。選擇未開傘、大小均勻、色澤黃褐、無破損、無畸形、無病蟲危害的香菇。

1.2.2 CMP 的發(fā)酵及制備 參考文獻(xiàn)［1］方法：茯苓菌種活化→茯苓液體種子制備→CMP 發(fā)酵→過濾收集發(fā)酵液上清→濃縮→醇沉→離心→沉淀物烘干→CMP 粗品→Sevage 法除蛋白→取上清烘干→CMP 樣品，備用。

1.2.3 多酚氧化酶活性的測(cè)定 （1）香菇多酚氧化酶的提取。參考文獻(xiàn)［12］方法：取1.0 g 香菇樣品，加入pH 7.0 磷酸鹽緩沖液3.0 mL，在冰浴條件下研磨勻漿并轉(zhuǎn)移到離心管中，再用7.0 mL 磷酸鹽緩沖液沖洗研缽，合并提取液靜止40 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，上清液即為PPO 粗提液，收集并于4 ℃冰箱保存待用。

（2）CMP 溶液對(duì)香菇多酚氧化酶體外活性抑制作用的測(cè)定。分別向試管中加5 mL pH 值7.0的磷酸緩沖液（0.05 moL/L），分別加入1 mL 2、4 、6、8、10 mg/mL 的CMP 溶液，40 ℃溫 度 下水 浴10 min 后，加入預(yù)熱的酶液1 mL，平衡10 min，然后加入1 mL 預(yù)熱鄰苯二酚（0.3 mol/L），開始計(jì)時(shí)，每30 s 記錄1 次OD420 隨時(shí)間的變化值，以最初直線段的斜率計(jì)算酶活力。以未加酶液為對(duì)照組，以未加CMP 溶液組的酶活為起始酶活。一個(gè)酶活力單位定義為在測(cè)定條件下，每分鐘引起光密度值改變0.001 所需的酶量［9，13-14］，CMP 溶液處理前后酶活變化以酶活抑制率表示，并以CMP 質(zhì)量濃度為X軸，以孢子萌發(fā)抑制率為Y軸繪制擬合曲線并建立抑制率回歸方程。

1.2.4 保鮮試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將香菇隨機(jī)分成4 組，每組25 個(gè)樣品，分別用3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的CMP 溶液噴灑香菇表面20 s，即5、10、20 mg/mL CMP 溶液處理組實(shí)驗(yàn)。不做任何處理對(duì)照組（control check，CK）。處理結(jié)束后，自然晾干表面水分，將4 組香菇分別裝入保鮮袋中放置于4 ℃冰箱中貯藏，每4 d 分別從每組取樣測(cè)定其感官品質(zhì)、可溶性蛋白、還原糖、總糖和抗壞血酸（vitamin C，VC）質(zhì)量濃度，各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次。

1.2.5 保鮮試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo) （1）香菇感官品質(zhì)評(píng)分指標(biāo)測(cè)定。參考高帥平等［15］的感官品質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，并且固定5 人每4 d 對(duì)香菇的感觀品質(zhì)進(jìn)行評(píng)分，從色澤，硬度，氣味，開傘度分別評(píng)價(jià)，權(quán)重依次為30%，30%，30%，10%。

（2）可溶性蛋白含量測(cè)定。參考Huang 等［16］方法：采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。準(zhǔn)確稱取1.0 g 香菇，加入10 mL 磷酸緩沖液（pH=7），冰浴中充分研磨，離心。吸取上清液1 mL 于試管中，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置5 min 后測(cè)定595 nm 下的吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量。

（3）還原糖和總糖含量測(cè)定。樣品處理參考姜天甲［17］的方法，還原糖標(biāo)曲的制備參考國標(biāo)法NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的測(cè)定3，5-二硝基水楊酸比色法》，總糖標(biāo)曲的制備參考國標(biāo)法SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定苯酚-硫酸法》。取上清液，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法操作，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品提取液中總糖和還原糖的含量。

（4）VC 含量測(cè)定。樣品處理參考姜天甲［17］的方法，采用2，6-二氯靛酚法［16］進(jìn)行測(cè)定。

（5）總酚含量測(cè)定。樣品處理及測(cè)定參考姜天甲［17］的方法。樣品處理：稱取5 g 樣品于研缽中，加入10 mL 預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇充分研磨后倒入錐形瓶中，搖床搖動(dòng)20 min，充分提取，離心，吸取上清液1 mL，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法操作，760 nm 測(cè)定其吸光值，計(jì)算總酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 計(jì)算出各指標(biāo)含量，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 2019 繪制作出柱形圖，采用GraphPad Prism 5 繪制折線圖同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液對(duì)香菇多酚氧化酶體外酶活的影響

用香菇多酚氧化酶體外酶活實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)CMP溶液對(duì)香菇PPO 體外酶活的是否具有抑制效果，根據(jù)圖1（a）結(jié)果所示，CMP 對(duì)香菇PPO 體外酶活具有抑制作用。并擬合CMP 溶液對(duì)香菇PPO 體外酶活抑制率的回歸方程為Y=4.442 5X+ 30.398，R2=0.952 5。根據(jù)抑制率回歸方程計(jì)算得到CMP溶液對(duì)香菇PPO 體外酶活的IC50=4.41 mg/mL，IC90=13.42 mg/mL。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

2.2 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對(duì)香菇感官品質(zhì)的影響

香菇采后自身代謝活動(dòng)依舊活躍，受外界的影響對(duì)其外觀及氣味都有一定的影響，感官指標(biāo)是評(píng)價(jià)商品品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一，直接影響著商品價(jià)值［15］。貯藏期間香菇的感官指標(biāo)變化如圖1（b）所示，在貯藏期間處理組均高于對(duì)照組，CMP 溶液處理組香菇的感官評(píng)分與對(duì)照組感官評(píng)分相比具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明CMP溶液處理組對(duì)香菇感官評(píng)定具有一定的效果，其中10、20 mg/mL CMP 溶液處理組效果更好些（P＜0.05），有利于香菇貯藏期的延遲。

2.3 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對(duì)香菇可溶性蛋白含量的影響

香菇在采后貯藏期間，蛋白質(zhì)會(huì)在蛋白酶的作用下分解產(chǎn)生氨基酸和多肽，同時(shí)會(huì)釋放菇體生命活動(dòng)所需的能量，隨著貯藏時(shí)間的延長進(jìn)一步衰老，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)低［18］。蛋白質(zhì)含量的高低影響著香菇的營養(yǎng)價(jià)值，也在一定程度上反映了機(jī)體的抗氧化水平。由圖2（a）可知，香菇可溶性蛋白質(zhì)含量隨著貯藏期的延長呈下降趨勢(shì)。處理組香菇蛋白質(zhì)貯藏前期（4~12 d）下降速率緩慢，對(duì)照組貯藏期在4 d 后開始急速下降，其主要原因可能是貯藏前期處理組香菇的蛋白質(zhì)分解代謝低于對(duì)照組。貯藏前期對(duì)照組可溶性蛋白含量高于處理組可能跟香菇自身的水分散失有關(guān)［19］。貯藏期達(dá)到第20 d 時(shí)，5、10、20 mg/mL CMP 溶液處理組分別是對(duì)照組的139.82%、145.01%、186.58%。結(jié)果表明20 mg/mL CMP 溶液與對(duì)照組相比能夠有效抑制可溶性蛋白質(zhì)的分解（P＜0.05），延緩可溶性蛋白質(zhì)含量的下降速率。

2.4 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液對(duì)香菇還原糖和總糖含量的影響

還原性糖是采后呼吸作用的主要底物，隨著貯藏時(shí)間的延長，機(jī)體呼吸作用不斷消耗糖類物質(zhì)，導(dǎo)致香菇的還原糖含量下降，這與腐爛程度也有一定關(guān)系［15］，同時(shí)也是香菇營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)。由圖2（b）可知，香菇還原糖含量隨著貯藏期的延長呈下降趨勢(shì)，處理組在貯藏中期（8~16 d）較對(duì)照組來說下降緩慢（P＜0.05），原因可能是香菇體內(nèi)大分子化合物的分解，促進(jìn)了小分子還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升［20］，CMP 5 mg/mL 處理組下降趨勢(shì)要小于其他處理組，貯藏期20 d 時(shí)，5，10，20 mg/mL CMP溶液處理組分別是對(duì)照組的220.39%，135.53%，128.25%。說明處理組的香菇與對(duì)照組相比能保持較高的還原糖含量，延緩香菇的品質(zhì)下降。

圖2 不同濃度CMP 溶液處理對(duì)香菇可溶性蛋白含量（a），還原糖含量（b），總糖含量（c），VC 含量（d），總酚含量（e）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of CMP solutions on soluble protein content（a），reducing sugar content（b），total sugar content（c），VC content（d）and total phenol content（E）of L.edodes

總糖在香菇采后貯藏中是其代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，含量的下降是組織衰老的重要指標(biāo)。貯藏期間總糖含量變化，由圖2（c）可知，處理組香菇總糖含量變化呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，對(duì)照組香菇總糖含量變化呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。處理組總糖含量后期均呈上升趨勢(shì)，可能是由于噴施的外源多糖對(duì)香菇內(nèi)源糖源產(chǎn)生的影響。貯藏期達(dá)到第20 d 時(shí)，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組香菇總糖含量變化分別是對(duì)照組的157.36%，146.22%，166.37% 。結(jié)果表明，CMP 溶液處理香菇有利于保持較高的香菇總糖含量，提高了香菇的營養(yǎng)品質(zhì)，其中20 mg/mL CMP 溶液效果最好（P＜0.05）。

2.5 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對(duì)香菇VC 含量的影響

貯藏前期VC 含量下降可能與子實(shí)體后熟衰老和品質(zhì)劣變有關(guān)［21］，香菇貯藏期間VC 含量變化，由圖2（d）可知，處理組香菇VC 含量變化先下降后上升再維持在一定水平，與姜天甲［17］的研究結(jié)果一致，對(duì)照組VC 含量變化先下降后上升再下降。貯藏前4 d，對(duì)照組VC 含量急劇下降，處理組下降緩慢（P＜0.05），前4 d VC 含量急劇下降是由于香菇的呼吸作用及氧化作用的進(jìn)行［17］，由于香菇后熟過程中伴隨著維生素C 的合成代謝，在貯藏初期呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)［22］，隨后香菇子實(shí)體的維生素C 由于分解代謝，以及抗氧化反應(yīng)，含量下降［23］。貯藏后期（12 d 后）處理組維持在較高水平，延緩VC 的消耗，貯藏20 d 時(shí)，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組分別是對(duì)照組的132%，170%，180%。結(jié)果表明：處理組具有延緩香菇中VC 含量效果。

2.6 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對(duì)香菇總酚含量的影響

酚類物質(zhì)許多是木質(zhì)素合成的前體，食用菌中的酚類物質(zhì)與其抗氧化活性有一定的關(guān)聯(lián)性，酚類物質(zhì)的氧化是香菇采后褐變的主要原因，嚴(yán)重影響香菇的商品價(jià)值和外觀品質(zhì)［24］。香菇貯藏期間總酚含量變化如圖2（e）所示，香菇總酚含量均呈下降趨勢(shì)，處理組數(shù)據(jù)高于對(duì)照組。貯藏期達(dá)到第12 d 時(shí)，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組香菇總酚含量變化分別為是對(duì)照組的114.47%，116.46%，121.41%。貯藏期達(dá)到第20 d 時(shí)，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組香菇總酚含量變化分別為是對(duì)照組的113.65%，95.45%，108.55%。結(jié)果表明，20 mg/mL CMP 溶液處理對(duì)延緩香菇總酚含量的下降，在貯藏前期具有一定效果（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)CMP 溶液對(duì)香菇多酚氧化酶體外酶活具有抑制效果IC50=4.41 mg/mL，IC90=13.42 mg/mL，隨后采用CMP 溶液處理香菇，在低溫貯藏期間對(duì)其營養(yǎng)物質(zhì)和外觀品質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，CMP 溶液處理香菇可以不同程度地提高低溫條件下香菇的貯藏品質(zhì)，可溶性蛋白含量變化與蘇倩倩等［18］的研究結(jié)果相似，隨著貯藏時(shí)間的延長，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。香菇還原糖含量呈下降趨勢(shì)，是由于子實(shí)體呼吸作用不斷消耗糖類物質(zhì)。處理組維持了較高含量的還原糖最高提升了120.39%，說明CMP 溶液處理香菇可以不同程度的對(duì)其呼吸作用產(chǎn)生抑制效果，這與陶璐等［25］采用山楂果膠寡糖處理香菇結(jié)果一致。處理組總糖后期上升的原因，可能是噴灑的外源多糖對(duì)香菇內(nèi)源糖源造成的影響。貯藏期間處理組香菇VC 含量變化先下降后上升再維持在一定水平，這與姜天甲［17］的結(jié)果一致。貯藏前期CMP 溶液處理延緩了香菇總酚含量的下降，說明CMP 溶液的抗氧化性及對(duì)香菇多酚氧化酶的抑制作用在香菇貯藏前期有效，后期效果不顯著可能是由于香菇自身氧化大于抗氧化能力。CMP 溶液對(duì)香菇體內(nèi)酶活活性的影響，還有待測(cè)定。

CMP 溶液對(duì)香菇PPO 體外活性具有抑制作用，CMP 溶液處理延緩香菇采后可溶性蛋白、還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)含量的下降，同時(shí)延緩香菇的感官評(píng)定指標(biāo)的下降，貯藏前期對(duì)延緩總酚含量下降起到作用，從而提高香菇的貯藏品質(zhì)，延長其貨架期。其中20 mg/mL CMP 溶液處理的效果最好，為CMP 的應(yīng)用發(fā)展提供了一條新途徑和香菇采后保鮮提供了有效的基礎(chǔ)理論與技術(shù)的支撐。