石 成，呂 中

武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

細(xì)菌引起的感染已成為威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，抗生素是治療細(xì)菌感染的主要藥物［1］。隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性問題［2-3］，而新批準(zhǔn)上市的抗生素越來越少［4］，因此開發(fā)新型抗菌劑迫在眉睫。

近年來一類具有類似天然酶活性的納米材料——納米酶廣受關(guān)注。納米酶具有類似天然酶的高效催化活性，同時(shí)還具有穩(wěn)定性強(qiáng)、易于生產(chǎn)且成本低的優(yōu)點(diǎn)，在生化檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域顯示出了巨大應(yīng)用前景［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)具有過氧化物酶活性的納米酶具有抗菌活性，且細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性［6-7］。這些納米酶通過催化過氧化氫（H2O2）產(chǎn)生毒性更高的羥基自由基（?OH）等活性氧物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生殺傷作用。目前已報(bào)道的具有抗菌活性的納米酶主要有金屬單質(zhì)及金屬氧化物等，例如，Wu 等［8］合成具有過氧化物酶性能的鉑中空納米枝晶，對(duì)小鼠的傷口感染具有較好療效；Wang 等［9］合成鈷釩混合金屬氧化物納米酶，對(duì)大腸桿菌具有高效的殺傷效果。

氧化銅（CuO）是一種性能優(yōu)良的P 型多功能窄禁帶半導(dǎo)體，其制造成本低且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，已廣泛應(yīng)用于氣體傳感器、催化、電池以及高溫超導(dǎo)體等領(lǐng)域［10］。目前已報(bào)道CuO 具有過氧化物酶活性［11］，可用于廢水處理［12］和分子檢測(cè)［13］等領(lǐng)域，但利用其過氧化物酶活性進(jìn)行抗菌的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為模板合成納米CuO，使材料具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性［14-15］。進(jìn)一步研究所合成材料的過氧化物酶活性及抗菌活性，為開發(fā)生物相容性好的納米酶抗菌劑提供實(shí)例。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與儀器

BSA（阿拉丁試劑有限公司）；三水合硝酸銅［Cu（NO3）2·3H2O］（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司）；3，3'，5，5'-四 甲 基 聯(lián) 苯 胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）（Sigma-Aldrich 有限公司）；對(duì)苯二甲酸（terephthalic acid，TA）（Adamas 有限公司）；其他試劑均采用分析純。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus，ATCC9118）（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；Mueller-Hinton（MH）生物培養(yǎng)基（AOBOX 有限責(zé)任公司）。

X-射線 衍 射 儀（X-ray diffractometer，XRD）（型號(hào)SmartLab SE，日本理學(xué)株式會(huì)社）、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM）（型號(hào)SU8010，日立高新技術(shù)公司）、激光粒度儀（laser particle size analyzer，DLS）（型號(hào)Zetasizer Nano ZS，英國(guó)馬爾文儀器有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)（ultra-violet and visible spectrophotometer，UV-vis）［型號(hào)UV-1900，島津儀器（蘇州）有限公司］、熒光分光光度計(jì)（型號(hào)F-4700，日立高新技術(shù)公司）、同步熱分析儀（synchronous thermal analyzer， TGA）（ 型 號(hào)STA449F5 Jupiter，德國(guó)耐馳儀器制造有限公司）、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）（型號(hào)TENSON II，德國(guó)布魯克公司）。

1.2 CuO-BSA 納米復(fù)合物的制備與表征

將60 mg Cu（NO3）2·3H2O 和125 mg BSA 分別溶解在25 mL 水中，混合后在室溫下攪拌30 min，緩慢滴加1 mL 氫氧化鈉（1 mol/L）溶液，將混合物置于85 ℃水浴反應(yīng)2 h。將反應(yīng)后的溶液于10 000 r/min 下離心15 min 收集沉淀，分別用純水和無水乙醇各洗滌3 次，冷凍干燥后得到CuO-BSA。另外，在不加BSA 且其他條件不變的情況下合成CuO。

采用XRD 對(duì)合成的材料組成進(jìn)行分析，掃描角度為20°~90°；采用TGA 和FTIR 分析材料的組分；采用DLS 分析材料的粒徑；采用FE-SEM 觀察CuO-BSA 納米復(fù)合物的形貌及大小。

1.3 CuO-BSA 納米復(fù)合物的過氧化物酶活性及穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)測(cè)定

CuO-BSA 的過氧化物酶活性測(cè)定：在醋酸緩沖液（pH 4.0，0.2 mol/L）中依次加100 μL 2 mg/mL的CuO-BSA 復(fù)合物、50 μL 100 mmol/L 的H2O2溶液和50 μL 24 mmol/L 的TMB 溶液構(gòu)成2 mL 體系，于35 ℃反應(yīng)20 min，12 000 r/min 條件下離心2 min，取上清液進(jìn)行UV-vis 掃描。以CuO-BSA+TMB 組、H2O2+TMB 組 以 及 單 獨(dú)TMB 組 作 為 對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)研究采用固定一種底物濃度，測(cè)定反應(yīng)速率隨另一種底物濃度變化的曲線。

CuO-BSA 催化TMB 動(dòng)力學(xué)測(cè)定：向1 800 μL醋酸鹽緩沖液中分別加入50 μL濃度為400 mmol/L的H2O2溶液、50 μL 濃度分別為0.4~24 mmol/L 的TMB 溶液和100 μL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的CuOBSA復(fù)合物，混勻后進(jìn)行UV-vis掃描。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

CuO-BSA 催化H2O2動(dòng)力學(xué)測(cè)定：向1 800 μL醋酸鹽緩沖液中分別加入50 μL 濃度為24 mmol/L的TMB溶液、50 μL濃度分別為0.4~4 mol/L的H2O2溶液和100 μL 質(zhì)量濃度 為2 mg/mL 的CuO-BSA復(fù)合物，混勻后進(jìn)行UV-vis 掃描。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

所有反應(yīng)均是測(cè)定反應(yīng)開始300 s 內(nèi)氧化態(tài)TMB（oxidation state TMB，oxTMB）在652 nm 處的吸光度隨時(shí)間變化的曲線，然后由公式（1）計(jì)算得到相對(duì)應(yīng)濃度底物的初始反應(yīng)速率V，如下：

其中，ΔC為Δt時(shí)間段內(nèi)oxTMB 的濃度變化值，ΔA為Δt時(shí)間段內(nèi)oxTMB 在652 nm 處的吸光度變化 值，ε為oxTMB 在652 nm 處的摩爾吸光 系 數(shù)［39 000（mol/L）-1·cm-1］［16］，L為光程長(zhǎng)（1.0 cm）。

然后，對(duì)初始反應(yīng)速率V和初始體系中的底物濃度［S］用米氏方程［Michaelis-Menten 擬合（公式2）］［16］，如下：

其中，V為初始反應(yīng)速率，［S］為底物濃度，Vmax為最大反應(yīng)速率，Km為米氏常數(shù)。Km值反應(yīng)納米酶對(duì)底物的親和力，值越小，說明酶對(duì)底物的親和力越高，反之則越低。

1.4 羥基自由基測(cè)定

在醋酸緩沖液中加入100 μL 2 mg/mL 的CuO-BSA 復(fù)合物、100 μL 20 mmol/L 的H2O2溶液和100 μL 10 mmol/L 的TA 溶液構(gòu)成2 mL 體系，反應(yīng)2 h，測(cè)定315 nm 激發(fā)下的熒光光譜。以CuOBSA+TA 組、H2O2+TA 組 和 單 獨(dú)TA 組 作 為 對(duì) 照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 CuO-BSA 復(fù)合物催化H2O2抗菌活性測(cè)定

將100 μL 1×106CFU/mL 菌 液 與 終 濃 度 為1 mmol/L H2O2和100 μg/mL CuO-BSA 混合，反應(yīng)體系為2 mL，37 ℃培養(yǎng)1 h，取菌液涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以細(xì)菌+H2O2、細(xì)菌+CuO-BSA 和細(xì)菌三組作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次取3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

圖1（a）為所合成的CuO-BSA 和CuO 的XRD圖譜。從圖中可知，CuO-BSA 和CuO 兩者衍射峰與單斜CuO 的標(biāo)準(zhǔn)卡片譜（JCPDS 48-1548）對(duì)應(yīng)，表明這2 種材料均為CuO。圖1（b）為CuO-BSA、CuO 和BSA 的TGA 圖譜?？芍?，當(dāng)溫度達(dá)到600 ℃時(shí)，CuO-BSA 剩余的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為74%，CuO 剩余的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為95%，BSA 剩余的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為22%，這說明CuO-BSA 上負(fù)載有BSA。從FTIR 圖中可以看出，CuO-BSA 在1 653 cm-1和1 559 cm-1處、BSA 在1 653 cm-1和1 540 cm-1處均各有2 個(gè)肽鍵特征峰，而CuO 處無相應(yīng)的特征峰，這進(jìn)一步說明CuO-BSA 上存在著BSA［圖1（c）］。合成的CuO-BSA 平均粒徑為201.2 nm［圖1（d）］。圖1（e）和圖1（f）為CuO-BSA 的FE-SEM 圖。從圖中可知，CuO-BSA 為梭狀，表面粗糙，顆粒大小分布較為均勻，顆粒的尺寸與DLS 結(jié)果基本一致。

圖1 CuO-BSA 納米復(fù)合物的表征：（a）XRD 圖譜，（b）TGA 曲線，（c）FTIR 圖譜，（d）DLS 圖，（e，f）FE-SEM 圖Fig.1 Characterization of CuO-BSA nanocomposites：（a）XRD patterns，（b）TGA curves，（c）FTIR spectra，（d）DLS diagram and（e，f）FE-SEM images

2.2 CuO-BSA 復(fù)合物的過氧化物酶活性

過氧化物酶催化H2O2還原，同時(shí)無色底物TMB 氧化為藍(lán)色的oxTMB，其在652 nm 處有最大吸收峰［8］，反應(yīng)式（3）如下：

基于此，CuO-BSA 復(fù)合物的過氧化物酶活性結(jié)果如圖2（a）所示。單獨(dú)TMB 體系和TMB+CuO-BSA 體系在652 nm 未出現(xiàn)特征吸收峰，說明TMB 沒有發(fā)生氧化反應(yīng)。無CuO-BSA 時(shí)，TMB+H2O2體系在652 nm 處有1 個(gè)弱的吸收峰，說明TMB 能被H2O2弱氧化。CuO-BSA 存在時(shí)652 nm處吸收值顯著增加，表明反應(yīng)體系中產(chǎn)生了更多氧化產(chǎn)物oxTMB。綜上結(jié)果表明，CuO-BSA 復(fù)合物能催化H2O2氧化TMB，具有類似天然過氧化物酶的活性。

進(jìn)一步考察材料濃度、pH 和溫度對(duì)CuO-BSA類酶活性的影響。由圖2（b）可知，隨著CuO-BSA濃度增加，反應(yīng)速率增加，表明CuO-BSA 的催化活性存在濃度依賴關(guān)系。CuO-BSA 復(fù)合物的類酶活性受pH 和溫度的影響，酶催化反應(yīng)存在最適pH 和最適溫度，pH 為4 和溫度為55 ℃時(shí)反應(yīng)速率達(dá)到最大。隨著pH 和溫度的增加，反應(yīng)速率反而下降，當(dāng)pH 為6 時(shí)，CuO-BSA 復(fù)合物僅保留26.0%的相對(duì)活性，而當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到75 ℃時(shí)，該復(fù)合物的相對(duì)活性僅存22.4%［圖2（c）和圖2（d）］。天然辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的最適溫度為40 ℃，并且55 ℃時(shí)活性僅剩約50%［17］。CuO-BSA 復(fù)合物與天然HRP 相比，最適溫度提高約15 ℃，表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性以及能承受更高的反應(yīng)溫度。

圖2 CuO-BSA 過氧化物酶活性及反應(yīng)條件對(duì)酶活性的影響：（a）CuO-BSA過氧化物酶活性，（b）不同濃度的CuO-BSA過氧化物酶活性，（c）pH,（d）溫度Fig.2 CuO-BSA peroxidase activity and effect of reaction conditions on enzyme activity：（a）CuO-BSA peroxidase activity，（b）CuO-BSA peroxidase activity at different concentrations，（c）pH，（d）temperature

2.3 CuO-BSA 復(fù)合物的過氧化物酶穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)

CuO-BSA 復(fù)合物催化H2O2氧化TMB 的反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系見圖3，通過Origin 2018 軟件計(jì)算得出CuO-BSA 復(fù)合物對(duì)底物TMB 和H2O2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax值和Km值，列于表1 中，并與天然HRP 以及已報(bào)道的Fe3O4納米酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。復(fù)合物CuO-BSA 對(duì)底物TMB 的Km值為0.29 mmol/L，低 于HRP，高 于Fe3O4，說 明CuO-BSA 對(duì)底物TMB 的親和力高于HRP，卻比Fe3O4納米酶低。另一方面，CuO-BSA 對(duì)底物H2O2的Km值 低 于Fe3O4，高 于HRP，說 明CuO-BSA 對(duì)底物H2O2的親和力高于Fe3O4，卻又低于HRP。CuO-BSA 對(duì)底物TMB 和H2O2的Vmax值比HRP、Fe3O4對(duì)兩種底物的Vmax值低。以上結(jié)果表明，用生物大分子BSA 作為模板和分散劑合成的納米CuO，對(duì)底物TMB 表現(xiàn)出的親和力較天然HRP 更高。

表1 CuO-BSA 與HRP 及Fe3O4納米酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of kinetic parameters of CuO-BSA with HRP and Fe3O4 nanozymes

圖3 CuO-BSA 復(fù)合物的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線：（a）反應(yīng)速率隨TMB濃度變化的曲線，（b）反應(yīng)速率隨H2O2濃度變化的曲線Fig.3 Steady-state kinetic curves of CuO-BSA complex：（a）curve of reaction rates at different TMB concentrations，（b）curve of reaction rates at different H2O2 concentrations

2.4 羥基自由基測(cè)定

文獻(xiàn)［19］表明，Au/CuS 納米復(fù)合物的過氧化物酶活性來源于納米粒子表面Cu2+的芬頓反應(yīng)，其反應(yīng)如下：

在反應(yīng)過程中，Cu2+催化H2O2生成大量具有強(qiáng)氧化性的?OH，該?OH 能氧化底物生成有色底物。因此，推測(cè)CuO-BSA 納米復(fù)合物的過氧化物酶活性也可能來源于該納米粒子表面的Cu2+的芬頓反應(yīng)，反應(yīng)如上，該過程中產(chǎn)生了強(qiáng)氧化性的?OH，使得底物TMB 氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物oxTMB。

為了探究CuO-BSA 催化反應(yīng)機(jī)理，用TA 作為熒光探針來檢測(cè)?OH 的產(chǎn)生。TA 本身沒有熒光，其捕獲?OH 并與其反應(yīng)形成有熒光的2-羥基對(duì)苯二甲酸（2-hydroxyterephthalic acid，TA-OH）復(fù)合物［20］。如圖4所示，單獨(dú)的H2O2產(chǎn)生少量?OH，CuO-BSA 存在時(shí)催化H2O2產(chǎn)生?OH 的量顯著增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CuO-BSA 催化H2O2氧化TMB 反應(yīng)的過程中產(chǎn)生了具有強(qiáng)氧化性的?OH。

圖4 TA 捕獲?OH 的熒光光譜圖，插圖為對(duì)應(yīng)曲線的放大圖Fig.4 Fluorescence spectra of TA capturing?OH，inset showing enlarged view of corresponding curve

2.5 CuO-BSA 復(fù)合物催化H2O2抗菌活性

CuO-BSA 能催化H2O2產(chǎn)生?OH，而?OH 抗菌活 性 高 于H2O2［21］，基于 此，評(píng) 估 了CuO-BSA 與H2O2聯(lián)用對(duì)S.aureus的抗菌性能。從圖5 可以看出，CuO-BSA+H2O2組的細(xì)菌存活率僅為3.1%，而單獨(dú)CuO-BSA 組、單獨(dú)H2O2組則分別存活了73.5%和35.3%的細(xì)菌，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CuO-BSA+H2O2處理組。這一結(jié)果表明，CuO-BSA 復(fù)合物催化H2O2有顯著的殺菌效果，抗菌能力的提高與CuOBSA 催化H2O2產(chǎn)生?OH 有關(guān)。

圖5 CuO-BSA 與H2O2聯(lián)用對(duì)S.aureus 的抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity of CuO-BSA combined with H2O2 against S.aureus

3 結(jié) 論

本文以BSA 為模板，采用水熱法合成了具有較好生物相容性的CuO-BSA 納米復(fù)合材料。利用H2O2/TMB 比色體系證明了CuO-BSA 復(fù)合物具有過氧化物酶活性，在pH 為4 以及溫度為55 ℃條件下表現(xiàn)出最佳的酶活性，相比天然HRP，最適反應(yīng)溫度提高約15 ℃。動(dòng)力學(xué)研究表明，CuO-BSA對(duì)底物TMB 的親和力高于HRP。CuO-BSA 催化H2O2產(chǎn) 生?OH，對(duì)S. aureus有較好的殺菌效果。本研究為采用納米酶作為抗菌劑提供了實(shí)例。