孟舒婷， 周衛(wèi)平， 戴繪芬， 董德平， 董業(yè)峰， 葛仁美， 王惠民

（1.南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院檢驗科，江蘇 南通 226600；2.南通市通州區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 通州 226300；3.海安市中醫(yī)院檢驗科，江蘇 南通 226600；4.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇 南通 226601）

血清總膽紅素作為一項重要的臨床生化指標(biāo)，其檢測值的準(zhǔn)確性對臨床診斷肝臟疾病或膽道梗阻有重要意義[1]?；|(zhì)效應(yīng)、互換性和“單點濃度”正確度評價的局限性，易造成濕化學(xué)法總膽紅素檢測結(jié)果偏高，導(dǎo)致結(jié)果偏移。近年來，國內(nèi)外高度關(guān)注檢驗結(jié)果的一致性，檢驗結(jié)果一致性的關(guān)鍵是溯源，不確定度則是保證溯源可靠性的重要方法。總膽紅素屬于化學(xué)定義明確的小分子化合物，按ISO 17511文件[2]要求，總膽紅素測量結(jié)果可通過參考方法或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接或間接溯源至國際單位制（international system of units，SI）單位。常規(guī)檢測結(jié)果可溯源至參考方法或參考物質(zhì)，才能保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，實現(xiàn)同級別不同實驗室間檢測結(jié)果的互認[3-4]。

目前，國際上對不確定度評定方法的分類尚無公認標(biāo)準(zhǔn)，按照對輸入量分布類型的處理方式可分為3種：以測量不確定度表達指南（the Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）為框架的不確定度評定方法（GUM uncertainty framework，GUF）、蒙特卡洛法（Monte Carlo method，MCM）和自助法（bootstrap method，BM）。用于評定測量不確定度采用的MCM是一種通過重復(fù)采樣實現(xiàn)分布傳播的數(shù)值方法。與GUF利用線性化模型傳播不確定度的解析方法不同，MCM通過對輸入量Xi的概率密度函數(shù)（probability density function，PDF）離散采樣，由測量模型傳播輸入量的分布，計算獲得輸出量Y的PDF的離散采樣值，進而由輸出量的離散分布數(shù)值直接獲取輸出量的最佳估計值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和包含區(qū)間[5]。近年來，已有報道將MCM用于參考實驗室測定酶催化活性的不確定度評定[6-7]，但對合理評定多水平標(biāo)準(zhǔn)液構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的測量結(jié)果及其不確定度仍在探索中。本研究嘗試通過建立對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)模型，結(jié)合人工智能軟件，應(yīng)用MCM評定血清總膽紅素濃度的測量不確定度，為合理評定類似測量程序的不確定度提供新思路。

1 材料和方法

1.1 儀器

日本日立公司U-3310紫外/可見分光光度計，配備半導(dǎo)體控溫、點溫計裝置和反應(yīng)分析軟件；美國Fluke公司Hart Scientific 1521型電子溫度計（精度0.001 ℃）；意大利Hanna公司H198183型pH計（精度0.002）；德國Sartorius 公司BT25S電子天平（精度0.01 mg）；美國Millipore公司Direct-Q 3UV純水儀；德國Eppendorf公司Reference移液器。分光光度計、天平、pH計、溫度計和移液器均由南通市計量局進行檢定，分光光度計每天使用前自檢，天平、pH計每次使用前自校。

1.2 試劑

二甲亞砜（批號BCBN0845V）、碳酸鈉（批號MKAA0325V）、對氨基苯磺酸（批號BCBL5743V）、亞硝酸鈉（批號SCBJ4432V）、安息香酸鈉（批號SLHB7401V）、醋酸鈉（批號BCBN2082V），三羥甲基氨基甲烷[2-Amino-2-（hydroxymethyl）-1，3-propanediol Tris；批號SLBH9329V]，牛血清白蛋白（批號066K0708），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA；批號WXBB34432），四水酒石酸鉀鈉（批號SLBC8354V）和氫氧化鈉（批號SZBE0140V）購自美國Sigma公司；咖啡因（批號140703A）購自北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司；膽紅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（14061603）購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院。

1.3 樣品濃度測定

將國際臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）2014年參考實驗室外部質(zhì)量評價計劃國際比對樣本A、樣本B 2個濃度水平樣品用稱重法復(fù)溶至5 mL。記錄室溫下蒸餾水的質(zhì)量及水溫，查《1990水溫國際溫標(biāo)純水密度表》，換算實際復(fù)溶的體積。嚴格按照國際檢驗醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列表推薦的總膽紅素參考測量程序[8]（Doumas法）進行樣品濃度的測定，重復(fù)10次，計算樣本的濃度水平。

1.4 方法

基于MCM，利用MATLAB 2012a軟件實現(xiàn)對總膽紅素測量結(jié)果不確定度的評定

1.4.1 建模 建立評定總膽紅素不確定度的5個數(shù)學(xué)模型。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的數(shù)學(xué)模型為：

式中b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，x為各標(biāo)準(zhǔn)管的濃度，y為各標(biāo)準(zhǔn)管的對應(yīng)的吸光度值（A），a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，n為標(biāo)準(zhǔn)管的數(shù)量。各輸入量均具有相應(yīng)的概率密度分布。

1.4.2 MCM評定總膽紅素測量結(jié)果的不確定度 （1）MCM輸入。①定義輸出量Y，即需測量的量（被測量）；②確定與Y相關(guān)的輸入量；③建立Y和X1…XN之間的數(shù)學(xué)模型；④利用可獲信息，為Xi設(shè)定PDF，如正態(tài)分布、矩形（均勻）分布等；⑤選擇MCM試驗樣本量M。（2）MCM傳播。①從輸入量Xi的PDF中抽取M個樣本值；②根據(jù)測量模型計算每個隨機抽取樣本的相應(yīng)Y值。（3）MCM輸出。嚴格按照遞增次序?qū)個Y值進行排序，基于排序的模型值得到輸出量Y的PDF。（4）報告結(jié)果。①根據(jù)Y的PDF計算Y的估計值y及y的標(biāo)準(zhǔn)不確定度（u）；②根據(jù)Y的PDF計算給定包含概率p時對應(yīng)Y的包含區(qū)間 [ylow，yhigh]。

2 結(jié)果

2.1 用于MCM模擬的試驗數(shù)據(jù)

2014年國際比對樣本總膽紅素A值和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液數(shù)據(jù)見表1、表2。

表1 2014年國際比對樣本A和樣本B總膽紅素A值和統(tǒng)計結(jié)果

表2 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的統(tǒng)計數(shù)據(jù)

2.2 MATLAB軟件運行MCM程序及軟件模擬結(jié)果

2.2.1 MCM程序運行

在MATLAB軟件File菜單下輸入對應(yīng)的function函數(shù)（圖1）。點擊綠色箭頭圖標(biāo)運行，開始運算。為獲得95%置信概率下包含區(qū)間，將PDF采樣次數(shù)M設(shè)置為106次。MATLAB軟件對各輸入量進行隨機采樣，“random”表示隨機采樣。對各個PDF進行106次采樣后，通過軟件求得輸出量不確定度。根據(jù)建立的5個數(shù)學(xué)模型編寫Matlab程序，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度均值及其不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度均值及其不確定度、測量結(jié)果及其不確定度。

圖1 軟件中輸入function函數(shù)

2.2.2 MATLAB軟件模擬結(jié)果

（1）MATLAB軟件模擬生成的5組參數(shù)見圖2～圖7。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（b）頻數(shù)直方圖

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度均值（）頻數(shù)直方圖

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度均值（ ）頻數(shù)直方圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線截距（a）頻數(shù)直方圖

圖6 國際比對樣本A、樣本B濃度頻數(shù)直方圖

圖7 軟件命令窗口輸出運行數(shù)據(jù)

（2）MATLAB軟件模擬生成數(shù)據(jù)。參考實驗室條件下總膽紅素國際比對樣本A測定結(jié)果為：b=0.007 531 6，s=0.000 025 51；=87.284 4 mg/L，s=0.196 5；=0.657 917，s=0.000 365 4；a=0.000 525 16，s=0.002 699；= 39.368 8 mg/L，u=0.603 2；95%可信區(qū)間為38.188 0～40.553 5。樣本B測定結(jié)果為：b=0.007 531 6，s=0.000 025 51；= 87.284 4 mg/L，s=0.196 5；=0.657 917，s=0.000 365 4；a=0.000 525 16，s=0.002 699；=18.703 1 mg/L，u=0.296 4；95%可信區(qū)間為18.122 5～19.284 4。用自適應(yīng)MCM[9]驗證GUF包含區(qū)間，結(jié)果顯示，2組絕對偏差dlow和dhigh值均>數(shù)值容差0.05，GUF法的結(jié)果未通過MCM驗證[10]。

3 討論

血清總膽紅素是評估肝功能的重要常規(guī)指標(biāo)之一，對于患者病情的判斷、鑒別診斷有著重要的指導(dǎo)作用?？偰懠t素測定是具備完整的參考系統(tǒng)的項目，理論上可溯源至SI單位，從而實現(xiàn)總膽紅素項目的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化?？紤]到血清總膽紅素測定過程中存在明顯基質(zhì)效應(yīng)，且在常規(guī)測量條件下無法做到絕對避光，含測量不確定度信息的總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純品不可直接用于血清總膽紅素的校準(zhǔn)[8]。ISO/TS 25680規(guī)定：對于無適宜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/質(zhì)控物的檢測指標(biāo)，只能用方法學(xué)比對法進行評價[11]。因此，JCTLM列表推薦的參考方法（Doumas法）[12]成為總膽紅素參考測量系統(tǒng)解決臨床實驗室測量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化問題的關(guān)鍵，而測量不確定度的評定則是亟需解決的問題。

血清總膽紅素參考測量程序采用校準(zhǔn)曲線法，該方法通過對一系列已知含量的標(biāo)準(zhǔn)液進行最小二乘法回歸建模（partial least squares regression，PLS）繪制成校準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得的樣品信號值從校準(zhǔn)曲線得出待測總膽紅素濃度[13]。該曲線并非通過所有測量點，而是無限接近所有點，需進行精密度檢驗，判斷檢驗擬合有無異常。曲線擬合過程中的斜率與截距會間接影響曲線擬合的準(zhǔn)確性。本研究首次應(yīng)用MCM對總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線中的各個濃度的概率密度函數(shù)及吸光度的概率密度函數(shù)構(gòu)建測量模型，獲取了標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距的概率分布，直觀計算測量結(jié)果的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（不確定度）與相應(yīng)概率下的分布區(qū)間。

MCM作為GUF的一種替代和補充方法[9]，具備以下實際應(yīng)用優(yōu)勢：（1）如數(shù)據(jù)呈偏正態(tài)分布，第二類錯誤的發(fā)生率必然升高，MCM無需考慮變量間的相互作用和輸出量分布類型（如模型非線性）等局限認識，且模擬過程不受輸入量分布類型及相關(guān)性影響，避免了傳統(tǒng)GUF中k值偏于保守，擴展不確定度可能偏大的情況；（2）結(jié)果表達中，在確定包含區(qū)間時，MCM無需考慮包含因子，以區(qū)間的形式代替擴展不確定度，測量結(jié)果的不確定度更直觀，更易理解；（3）MCM借助計算機模擬過程，對相關(guān)輸入量的分布進行處理，避免了傳統(tǒng)GUF的繁瑣計算，顯著提升了效率。基于MCM評定測量不確定度引入主觀因素少，對測量模型采用“海量”數(shù)據(jù)模擬，減少了第二類誤差，可獲得更真實的測量結(jié)果均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（不確定度）、一定概率下（95%）的分布區(qū)間，更為精準(zhǔn)、適用范圍更廣。但MCM本質(zhì)是基于隨機抽樣，因此每次輸出結(jié)果會有細微差異，但對比組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[14]。目前，MATLAB軟件在影像學(xué)3D建模、心腦血管血流動力學(xué)分析中的應(yīng)用較多，但在醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域應(yīng)用較少，將MATLAB軟件用于檢驗領(lǐng)域具有一定的前瞻性，對于多濃度校準(zhǔn)曲線檢測有一定指導(dǎo)意義，可用于不同實驗室檢驗結(jié)果的互認。基于MCM原理，結(jié)合MATLAB軟件，本研究基于MCM對血清總膽紅素的不確定度進行了評定，運行結(jié)果與GUF結(jié)果比較，證明在經(jīng)典方式不適用的情況下，MCM是優(yōu)于GUF的不確定度評定方法。