侯玉麗， 王怡斐， 付靜軒， 王培昌

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系，北京 100069）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以失智、健忘和記憶力減退為主要臨床特征，嚴(yán)重威脅人類健康，給患者家庭和社會(huì)帶來極大的負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球約有5 000萬例AD患者，2025年預(yù)計(jì)將達(dá)到1.3億例[2]。AD已成為人類第5大死因[3-4]。因此，研究AD的分子機(jī)制對(duì)于AD的干預(yù)具有重要意義。AD的病因復(fù)雜，目前主流的學(xué)說主要有Tau蛋白過度磷酸化假說、β-淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）沉積假說、膽堿能假說、線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激假說等，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是由多種發(fā)病因素、多種通路和分子機(jī)制的相互作用引起的[5]，而基因的改變是AD發(fā)生的根本原因。近年來，越來越多的學(xué)者通過基因測序技術(shù)與生物信息學(xué)分析結(jié)合的方法，初步篩選與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，為疾病的機(jī)制研究提供了新的靶標(biāo)和思路。本研究擬通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選出AD的差異表達(dá)基因，從中評(píng)選出關(guān)鍵基因并進(jìn)行驗(yàn)證，以期為AD的診斷和治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及篩選

在GEO公共數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.gov/geo）中以“Alzheimer's disease”及“Temporal cortex”作為關(guān)鍵詞，標(biāo)本信息來源于人類的“Expression profiling by array”進(jìn)行檢索，選擇AD患者腦組織數(shù)據(jù)集GSE118553作為分析數(shù)據(jù)集，GSE106241作為關(guān)鍵基因的驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。GSE118553數(shù)據(jù)集來源于GPL10558平臺(tái)，選取其中10名正常對(duì)照者的顳葉皮層組織和10例AD患者的顳葉皮層組織的基因表達(dá)信息；GSE106241數(shù)據(jù)集來源于GPL24170平臺(tái)，包括6名正常對(duì)照者和54例不同braak分級(jí)（braak 1級(jí)11例，braak 2級(jí)11例，braak 3級(jí)6例，braak 4級(jí)7例，braak 5級(jí)12例，braak 6級(jí)7例）AD患者顳葉皮層組織的基因表達(dá)信息及顳葉皮層組織中Aβ42的蛋白表達(dá)水平。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

采用R語言軟件中的limma程序包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，以|log FC|>0.8和校正后P<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析（包括生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)部分）、京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

采用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選combined score>0.4的互作蛋白。將PPI結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中，采用Cytohubba插件和MCC算法篩選評(píng)分居前10位的關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

以GSE106241數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，分析篩選出的10個(gè)關(guān)鍵基因在不同braak分級(jí)AD患者腦組織與正常對(duì)照者顳葉皮層組織中表達(dá)的差異及其與Aβ42表達(dá)的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用R語言軟件中的ggplot和pheatmap程序包繪制差異表達(dá)基因的火山圖及熱圖，采用clusterProfiler程序包進(jìn)行基因富集的分析及繪制。2個(gè)組之間比較采用Student t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估關(guān)鍵基因與Aβ42的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

從GSE118553數(shù)據(jù)集中篩選出157個(gè)差異表達(dá)的基因，其中表達(dá)上調(diào)88個(gè)、表達(dá)下調(diào)69個(gè)。采用pheatmap程序包繪制出|log FC|>0.8的前50個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)熱圖。見圖1。

圖1 AD患者腦組織中差異表達(dá)基因的篩選

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果

GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)進(jìn)程主要為細(xì)胞外成分、血管生成、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)等；涉及的細(xì)胞成分主要為運(yùn)輸囊泡、突觸膜、囊泡組分、突觸小泡等；涉及的分子功能主要為細(xì)胞外基質(zhì)成分、門控離子通道、γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）受體活性和蛋白聚糖結(jié)合等。見圖2。

圖2 差異表達(dá)基因的GO富集分析

KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要參與黏著斑形成、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）受體、GABA能突觸和藥物成癮等通路。見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

2.3 差異表達(dá)基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因的篩選結(jié)果

采用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建157個(gè)差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的評(píng)分居前10位的關(guān)鍵基因分別為SNAP25、SYT1、GRIN2A、SLC12A5、GAD1、GABRG2、GABRD、PVALB、GABRB2和FN1。由于FN1與其他關(guān)鍵基因的關(guān)聯(lián)不密切，后續(xù)未對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。見圖4。

圖4 差異表達(dá)基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因的篩選

2.4 關(guān)鍵基因驗(yàn)證結(jié)果

在GSE106241數(shù)據(jù)集中，不同braak分級(jí)AD患者之間腦組織SNAP25、SYT1、GRIN2A、SLC12A5、GAD1、GABRG2、GABRD、PVALB和GABRB2表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

圖5 不同braak分級(jí)AD患者腦組織中關(guān)鍵基因表達(dá)的比較

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，SNAP25、SYT1、SLC12A5表達(dá)與Aβ42表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.354、-0.283、-0.310，P<0.05），GRIN2A、GAD1、GABRG2、GABRD、PVALB、GABRB2與Aβ42表達(dá)無相關(guān)性（r值分別為-0.239、-0.257、-0.262、-0.260、-0.244、0.025，P>0.05）。

3 討論

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們對(duì)尋找各種疾病關(guān)鍵基因更加關(guān)注，關(guān)鍵基因信息的收集可為疾病的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路[6]。本研究利用基于GPL10558平臺(tái)的數(shù)據(jù)集GSE118553，對(duì)10例AD患者和10名正常對(duì)照者顳葉皮層組織中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出157個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)88個(gè)、表達(dá)下調(diào)69個(gè)。對(duì)差異表達(dá)基因的功能富集分析結(jié)果顯示，神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)、囊泡運(yùn)輸、突觸小泡和GABA受體的改變可能參與了AD的發(fā)病過程。本研究采用Cytoscape軟件分析了差異表達(dá)基因間的相互聯(lián)系，篩選出了與AD相關(guān)的10個(gè)關(guān)鍵基因（SNAP25、SYT1、GRIN2A、SLC12A5、GAD1、GABRG2、GABRD、PVALB、GABRB2和FN1）。這10個(gè)關(guān)鍵基因的功能與突觸傳遞、GABA信號(hào)通路、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、鈣離子通道和癲癇等相關(guān)[7-10]。采用GSE106241數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，不同braak分級(jí)的AD患者之間腦組織SNAP25、SYT1、GRIN2A、SLC12A5、GAD1、GABRG2、GABRD、PVALB和GABRB2表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SNAP25、SYT1、SLC12A5表達(dá)與Aβ42表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.354、-0.283、-0.310，P<0.05）。提示SNAP25、SYT1和SLC12A5基因表達(dá)與AD的發(fā)病顯著相關(guān)，值得進(jìn)行深入研究。

SNAP25基因定位于人染色體20p12.2，編碼的蛋白質(zhì)主要參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放活動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn)，SNAP25基因與AD和帕金森病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。有研究結(jié)果顯示，AD患者腦脊液和外泌體中的SNAP25蛋白表達(dá)均降低，且可在患者未發(fā)生認(rèn)知障礙時(shí)對(duì)AD進(jìn)行早期診斷[8]，與本研究結(jié)果一致。提示SNAP25在AD的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。SNAP25 rs363050基因多態(tài)性與AD患者的認(rèn)知功能下降和腦萎縮，以及意識(shí)恢復(fù)相關(guān)[9]，但關(guān)于SNAP25基因在AD致病機(jī)制中的作用尚不明確。

SYT1是突觸結(jié)合蛋白家族的成員，在前腦、中腦，以及大多數(shù)腦干和脊髓神經(jīng)元中表達(dá)[10]。SYT1作為突觸小泡膜表面的Ca2+傳感器，在胞吞胞吐和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。SYT1表達(dá)與學(xué)習(xí)和記憶能力呈正相關(guān)（r=0.852，P<0.001），與焦慮和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，SYT1介導(dǎo)的突觸功能與AD患者的記憶缺陷有關(guān)[13]，腦脊液中SYT1表達(dá)水平可作為AD的診斷標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果顯示，AD患者顳葉皮層組織中SYT1表達(dá)下調(diào)，且在不同braak分級(jí)患者之間有明顯差異；另外，SYT1表達(dá)與Aβ42表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.283，P<0.05）。提示SYT1或可作為AD診斷的新靶點(diǎn)。

SLC12A5是溶質(zhì)載體（solute carrier，SLC）家族中的一員。SLC家族是目前發(fā)現(xiàn)的最大的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在各種物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。SLC12A5作為膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)維持成熟神經(jīng)元中的低氯水平，使GABA受體去極化，維持神經(jīng)元的正常功能[15-16]。本研究結(jié)果顯示，AD患者顳葉皮層組織中SLC12A5表達(dá)下調(diào)，且在不同braak分級(jí)患者之間有明顯差異；另外，SLC12A5表達(dá)與Aβ42表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.310，P<0.05），提示SLC12A5與AD密切相關(guān)。

綜上所述，本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫篩選出3個(gè)與AD密切相關(guān)的基因（SNAP25、SYT1和SLC12A5），對(duì)其進(jìn)行深入研究可能有助于進(jìn)一步闡釋AD發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。但本研究尚缺少基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，因此后續(xù)將繼續(xù)收集臨床樣本，對(duì)篩選出的3個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行深入研究。