文舒展， 付子樂， 陳淑英

（1.復旦大學附屬華山醫(yī)院骨科，上海 200040；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，上海 200040）

微小RNA（microRNA，miRNA）是長度約22 nt的非編碼RNA，在后生動物和植物基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起關鍵作用[1]。miRNA由非外顯子區(qū)域基因組轉(zhuǎn)錄，成熟后可與目標信使RNA（messenger RNA，mRNA）結(jié)合，與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上可抑制其靶mRNA表達（在哺乳動物中比較普遍），或影響mRNA的穩(wěn)定性，引起靶mRNA的降解（在植物中比較常見）[2]。在許多重要的生物學過程中都有miRNA的參與，如細胞增殖和凋亡、血細胞發(fā)育、炎癥細胞激活、神經(jīng)發(fā)生、胎兒發(fā)育[2-3]。人微小RNA-34a（homo sapiens microRNA-34a，hsa-miR-34a）被認為是腫瘤抑制的主要調(diào)節(jié)因子，在許多腫瘤中表達缺失或降低[4]，通過miR-34a再表達治療腫瘤已成為一個重要的研究方向。本研究通過生物信息學方法預測hsa-miR-34a的靶基因，采用功能富集、信號通路富集、蛋白質(zhì)相互作用分析等方法對其進行分析，結(jié)合miR-34a在腫瘤中表達的變化，以期能進一步分析hsa-miR-34a在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，為后續(xù)的臨床和基礎研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 資料收集

在Pubmed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、Web of science（https：//www.webofscience.com/wos/alldb/basic-search）、OVID（https：//ovidsp.dc2.ovid.com/ovid-a/ovidweb.cgi）數(shù)據(jù)庫進行文獻搜索，文獻檢索主題詞：“hsa-miR-34a”“microRNA”“cancer”“bioinformatics analysis”“GO”“enrichment analysis”，對檢索到的文獻進行歸納整理，分析hsa-miR-34a在不同類型腫瘤中的表達變化。

1.2 miRNA同源性分析

采用UCSC Genome Browser（http：//genome-asia.ucsc.edu/index.html）對hsa-miR-34a對應基因組在人染色體上的位置進行定位，使用miRBase在線工具（http：//www.miRbase.org）檢索獲得不同物種中miR-34a的染色體定位和堿基序列，通過比對獲得同源保守序列。

1.3 靶基因預測

分別通過TargetScan（http：//www.targetscan.org/）、miRDB（http：//www.miRdb.org/）、miRWalk（http：//miRwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和mirDIP（http：//ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp）4個數(shù)據(jù)庫獲得hsamiR-34a的靶基因預測結(jié)果，取4個預測結(jié)果的交集，以mirDIP數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)為參照標準，采用Target Score功能進行排序，篩選前30個基因作為預測靶基因集。

1.4 靶基因表達分析

利用TiGER數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/）獲得靶基因集合在正常人體不同組織和器官中的表達情況。采用Graphpad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行可視化分析，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。

1.5 靶基因功能與通路富集分析

利用PANTHER（http：//pantherdb.org/）和DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）在線工具對靶基因集進行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析和REACTOME通路富集分析。

1.6 蛋白質(zhì)互作分析

將預測靶基因?qū)牡鞍踪|(zhì)名稱錄入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），得出靶基因?qū)鞍踪|(zhì)的相互關系網(wǎng)絡圖。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件對靶基因表達數(shù)據(jù)進行可視化分析，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。采用Fisher精確概率法統(tǒng)計通路富集分析數(shù)據(jù)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-34a在不同腫瘤中的表達情況

文獻檢索結(jié)果顯示，乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等腫瘤中hsa-miR-34a表達顯著降低，見表1。

表1 不同腫瘤中hsa-miR-34a的表達情況及作用

2.2 hsa-miR-34a同源性分析結(jié)果

通過miRBase、UCSC Genome Browser分析得到hsa-miR-34a對應基因組定位于人染色體1p36.22[9151668-9151777]，長度為110 bp，序列號為MI0000268。分析小鼠、獼猴等不同物種的miR-34a，發(fā)現(xiàn)“UGGCAGUGU”序列在不同物種間高度保守。見表2。

表2 不同物種中miR-34a的保守序列

2.3 hsa-miR-34a的靶基因預測結(jié)果

采用TargetScan、miRDB、miRWalk和mirDIP數(shù)據(jù)庫預測hsa-miR-34a的靶基因，分別得到靶基因數(shù)量為754、899、7 345、1 399個，取交集后得到225個靶基因，然后采用Target Score功能排序，選取前30個靶基因作為后續(xù)分析的靶基因集合，分別為：MDM4、DLL1、RAP1GDS1、FAM167A、HCN3、SDK2、FAM76A、E2F5、FKBP1B、PPP1R11、SCN2B、MGAT4A、NAV3、SYT1、SATB2、CELF3、XYLT1、MET、MYCN、PACS1、NAV1、CACNA1E、LGR4、TGIF2、VAMP2、FUT9、PKP4、RRAS、ABR、MSR1。

2.4 hsa-miR-34a靶基因的表達

采用TiGER數(shù)據(jù)平臺分析靶基因集在人體各組織器官中的表達，未查詢到FAM167A、CELF3、CACNA1E、PPP1R11、MGAT4A、PACS1、TGIF2、FUT9基因相關信息，22個靶基因在人體不同器官組織的特異性表達譜，見圖1。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同器官和組織之間各靶基因的相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1 22個靶基因在正常人體組織中的表達

2.5 hsa-miR-34a的靶基因GO富集分析結(jié)果

利用PANTHER在線工具對30個靶基因進行細胞組分和分子功能的GO富集分析，結(jié)果顯示，靶基因SYT1和VAMP2集中表達在網(wǎng)格蛋白囊泡及囊泡膜（P<0.000 1），轉(zhuǎn)運物質(zhì)包括谷氨酸、單胺、γ-氨基丁酸；獲得HCN3、SCN2B、SYT1、VAMP2基因GO分子功能注釋信息，主要與電壓門控鈉通道活性及與syntaxin-1蛋白有關（P<0.05）；成功獲得26個基因GO生物學過程注釋信息（P<0.05），主要集中于多細胞生物過程和發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育等。見表3、表4和圖2。

圖2 hsa-miR-34a預測靶基因的GO生物學過程分析結(jié)果

表3 hsa-miR-34a預測靶基因的GO細胞組分分析結(jié)果

表4 hsa-miR-34a預測靶基因的GO分子功能分析結(jié)果

2.6 hsa-miR-34a的靶基因通路富集分析

在GO富集分析的基礎上，利用已有的生物通路數(shù)據(jù)，通過DAVID在線工具對靶基因集進行REACTOME生物通路富集分析。結(jié)果顯示，hsa-miR-34a靶基因集中富集在B型和G型肉毒桿菌毒素毒性（富集倍數(shù)>300），同時還富集在人信號素4D（semaphorin 4D，Sema4D）介導的細胞黏附和遷移抑制，γ-氨基丁酸的合成、釋放、再吸收和降解，乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放循環(huán)等生物信號通路中。見表5。

表5 hsa-miR-34a預測靶基因的通路分析結(jié)果

2.7 hsa-miR-34a的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建hsa-miR-34a的30個靶基因?qū)鞍椎幕プ骶W(wǎng)絡，見圖3。根據(jù)靶基因?qū)鞍自谠摼W(wǎng)絡中的連接性，對靶基因重新進行排序，排在前5位的靶基因分別為SYT1、VAMP2、MET、RRAS、CACNA1E，這5個基因?qū)鞍椎年P聯(lián)值均>10。

圖3 hsa-miR-34a的30個靶基因?qū)鞍椎幕プ骶W(wǎng)絡

3 討論

miRNA屬于高度保守的非編碼RNA分子，可特異性識別靶基因3'非翻譯區(qū)（3' untranslated region，3' UTR）的相應靶位點，抑制特定靶基因的表達或降解靶基因。本研究結(jié)果顯示，hsamiR-34a在乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中的表達顯著降低。有研究結(jié)果顯示，hsa-miR-34a可通過抑制700多個與細胞增殖、存活和可塑性有關的轉(zhuǎn)錄物來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]，但具體作用機制尚不清楚。因此，對hsa-miR-34a進行多層面的生物信息學分析，對后續(xù)研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療有一定的指導意義。

目前已有一些研究提示了hsa-miR-34a抑癌的機制，在生理條件下，miR-34a在轉(zhuǎn)錄中沉默其原癌靶基因的表達，miR-34a的上調(diào)會導致細胞凋亡、細胞周期停滯、細胞衰老，進而可以抑制腫瘤細胞繁殖和遷移[4，22]，目前證實其涉及的靶基因、靶蛋白或信號通路有MET、CD44、Notch1、LEF1、E2F、PI3K/Akt等。miR-34a的低表達與其受到CpG甲基化修飾有關[23-24]，有研究證明，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）通過HPV E6/p53信號通路使miR-34a甲基化，抑制其表達，調(diào)節(jié)宮頸癌的Warburg效應，促進腫瘤的生長和侵襲[18]。

本研究選取進化程度不同的物種進行同源性分析，miR-34a對應基因序列在不同物種中的相似性較高，其中“UGGCAGUGU”序列為不同物種共同具有的保守區(qū)，人與倭黑猩猩、獼猴、婆羅洲猩猩等同源性較高的物種在基因上的位置也高度相似。本研究分析了22個靶基因在人體各器官和組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)大部分靶基因在人體各器官組織中均有表達，且在不同器官和組織中的表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），可見hsa-miR-34a的靶基因大部分具有廣譜表達性；miR-34a對應基因的高度保守性和靶基因的廣譜表達性提示miR-34對應基因可能有多個識別位點或多個靶標，發(fā)揮著重要的生物學功能。

本研究通過4個數(shù)據(jù)庫（TargetScan、miRDB、miRWalk和mirDIP）預測hsa-miR-34a的靶基因，結(jié)果不盡相同，且基因數(shù)差距較大，取交集后基因數(shù)仍有225個。這一方面提示miR-34a生物學功能的廣泛性和復雜性，另一方面也說明可能存在較高的假陽性率。因此，本研究采用Target Score功能對獲得的基因進行排序，選取前30個靶基因進行分析，以增加預測的精確度，但在精確度增加的同時可能會對結(jié)果的全面性產(chǎn)生一定的影響。

在30個靶基因中，MDM4、Notch1、LEF1、Jagged1等基因已被證明在miR-34a抑制腫瘤中發(fā)揮重要的作用，進一步驗證了miR-34a的抑癌作用。這些靶基因可作為分析miR-34a抑制腫瘤作用機制的重點方向。Target Score排序最高的基因為MDM4，是p53上游重要的調(diào)控因子。在生理條件下，miR-34a的轉(zhuǎn)錄主要由關鍵抑癌基因p53調(diào)控，通過與miR-34a區(qū)域附近多個典型的p53結(jié)合位點結(jié)合產(chǎn)生影響，但幾個反饋回路，如p53/miR-34a/MDM4反饋環(huán)提示miR-34a參與了p53的調(diào)節(jié)[21，25-26]。

相對于對單個靶基因的研究和分析，多個靶基因的整合富集分析有助于更直接和全面地了解miR-34a的生物學功能。本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-34a生物學功能廣泛，其靶基因集中表達于網(wǎng)格蛋白囊泡和囊泡膜及其物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞黏附和遷移、神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放、多細胞生物過程等，這些都可能對腫瘤發(fā)生的各階段產(chǎn)生影響，如miR-34a的靶基因富集于Sema4D介導的細胞黏附和遷移抑制，這很可能是miR-34a抑制腫瘤細胞黏附和遷移的重要機制，但目前尚缺乏直接的實驗證據(jù)。值得注意的是，本研究通路分析及組織表達分布的結(jié)果均具有較強的指向性，提示miR-34a在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、形成及功能中具有重要的意義，而腫瘤的發(fā)生與神經(jīng)因素也有著密不可分的關系[27]，由此推測miR-34a抑制腫瘤發(fā)生的機制可能與神經(jīng)因素調(diào)節(jié)有關。

綜上所述，本研究通過REACTOME通路分析和GO分析，初步探討了miR-34a的靶基因及其生物學功能，可為后續(xù)的臨床和基礎研究提供參考依據(jù)。