潘 芬， 潘雨萱， 石迎迎， 于方圓， 張 泓

（上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200062）

尿路感染（urinary tract infection，UTI）是兒童常見的感染之一[1-2]。清潔中段尿細(xì)菌定量培養(yǎng)是診斷UTI的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，傳統(tǒng)尿液培養(yǎng)一般需要3～4 d才能到細(xì)菌鑒定及藥物敏感性結(jié)果，且存在70%～80%的假陰性率，嚴(yán)重影響了臨床的及時(shí)治療[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，UroQuick快速培養(yǎng)法可在較短時(shí)間內(nèi)報(bào)告病原及其定量結(jié)果，有助于臨床早期診斷[5-6]。本研究擬通過比較UroQuick快速培養(yǎng)法和尿液定量培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果，探討UroQuick快速培養(yǎng)用于快速診斷、鑒別及排除兒童UTI的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2019年12月—2020年1月上海市兒童醫(yī)院門診及住院的235例疑似UTI的0～14歲患兒清潔中段尿樣本（剔除尿液污染或留取不規(guī)范的樣本），患兒男性132例、女性103例。

1.2 儀器與試劑

UroQuick尿液快速培養(yǎng)儀及配套試劑（意大利ALIFAX公司），MALDI-TOF質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司），哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱平板（上海伊華生物有限公司）。

1.3 尿液定量培養(yǎng)及細(xì)菌鑒定

嚴(yán)格按照第4版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[7]要求進(jìn)行清潔中段尿樣本細(xì)菌培養(yǎng)。用10 μL定量接種環(huán)獲取尿液，分別接種于血瓊脂平板和麥康凱平板，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下孵育18～20 h。當(dāng)平板菌落數(shù)≥10個(gè)時(shí)，挑取平板上單個(gè)菌落進(jìn)行分離純化，并采用MALDITOF質(zhì)譜儀鑒定到種。

1.4 UroQuick尿液快速培養(yǎng)

嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，采用無菌操作取500 μL的中段尿液，加入2 mL液體培養(yǎng)基中，混勻后放入U(xiǎn)roQuick尿液快速培養(yǎng)儀中孵育培養(yǎng)，通過激光散射技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)有細(xì)菌生長(zhǎng)（閾值為500 CFU/mL）時(shí)，儀器會(huì)給出樣本的濁度值，并根據(jù)生長(zhǎng)曲線采用非線性最小二乘擬合的算法計(jì)算出原始樣本中的菌量濃度。

培養(yǎng)報(bào)陽后，采用一次性針頭抽取1 mL液體培養(yǎng)基于1.5 mL Eppendorf管中，1 3 8 0 0×g離心5 m i n，棄上清，再加入300 μL 0.9%氯化鈉溶液，混勻后繼續(xù)離心5 min，去除多余的蛋白質(zhì)，再13 800×g離心5 min，棄上清，取適量沉淀物涂抹于MALDITOF靶板上，采用甲酸提取法[8]和MALDI-TOF質(zhì)譜儀快速鑒定細(xì)菌到種。同時(shí)，將離心沉淀物進(jìn)行革蘭染色涂片，分別接種于血瓊脂平板和麥康凱平板，第2天觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)一步鑒定以明確快速質(zhì)譜鑒定結(jié)果是否準(zhǔn)確；若3 h內(nèi)呈陰性，則轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板，于37 ℃5%CO2環(huán)境下孵育18～20 h，第2天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以明確是否為陰性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P2.5～P97.5）]表示。以尿液定量培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，分別按照濁度值和菌量濃度計(jì)算原則，采用McNemar χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)分析UroQuick快速尿液培養(yǎng)法的差異性和一致性。采用MedCalc軟件計(jì)算UroQuick快速培養(yǎng)診斷UTI的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中段尿定量培養(yǎng)結(jié)果

235例清潔中段尿樣本中，有58例培養(yǎng)出病原菌，陽性率為24.7%，其中43例培養(yǎng)出細(xì)菌，4例培養(yǎng)出真菌，11例2種病原均檢出。43株細(xì)菌中，革蘭陰性桿菌27株（62.8%），以大腸埃希菌多見；革蘭陽性球菌16株（37.2%），以屎腸球菌多見。見表1。

2.2 UroQuick尿液快速檢測(cè)結(jié)果

235例清潔中段尿樣本中，按照濁度值計(jì)算，UroQuick檢測(cè)法為陽性的有69例，陽性率為29.4%，其中55例培養(yǎng)出細(xì)菌、3例培養(yǎng)出真菌，11例2種病原均檢出。55株細(xì)菌中，革蘭陰性桿菌35株（63.6%），以大腸埃希菌多見；革蘭陽性球菌有20株（36.4%），以屎腸球菌多見；見表1。UroQuick檢測(cè)法陽性檢出率高于中段尿定量培養(yǎng)法，部分結(jié)果不一致的樣本進(jìn)一步結(jié)合尿常規(guī)檢測(cè)綜合分析，仍判斷為感染菌。

2.3 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較

以常規(guī)中段尿定量培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，將235例樣本分為陰性組（177例）和陽性組（58例），分析UroQuick尿液快速培養(yǎng)法的濁度值和菌量濃度（圖1），結(jié)果顯示，陰性組濁度值中位數(shù)為0，陽性組濁度值中位數(shù)為1.39，2個(gè)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；陰性組的菌量濃度為0 CFU/mL，陽性組菌量濃度為50萬 CFU/mL，2個(gè)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。進(jìn)一步分析2種方法細(xì)菌檢出結(jié)果的一致性，結(jié)果顯示，2種方法一致率為86.8%（204/235），其中陰性一致率為91.0%（161/177），陽性一致率為74.1%（43/58）。將2種方法分別與MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果結(jié)合，用于細(xì)菌鑒定，發(fā)現(xiàn)除2種或2種以上病原鑒定率較低外，UroQuick檢測(cè)法4～5 h即可得到病原鑒定結(jié)果，而尿液定量培養(yǎng)則需要18～24 h才能獲得結(jié)果。

圖1 UroQuick快速培養(yǎng)法在尿液定量培養(yǎng)陰性組和陽性組中的濁度、菌量濃度分布

2.4 UroQuick尿液快速檢測(cè)方法診斷UTI的效能

以常規(guī)中段尿液定量培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，以UroQuick檢測(cè)的濁度值作為計(jì)算原則，UroQuick快速培養(yǎng)法診斷UTI的敏感性為84.48%，特異性為88.70%，陽性預(yù)測(cè)值為71.01%，陰性預(yù)測(cè)值為94.58%；以UroQuick檢測(cè)的菌量濃度作為計(jì)算原則，UroQuick快速培養(yǎng)法診斷UTI的敏感性為82.76%，特異性為92.66%，陽性預(yù)測(cè)值為78.69%，陰性預(yù)測(cè)值為94.25%。見表2。

表2 UroQuick快速培養(yǎng)法診斷UTI的效能

UroQuick尿液快速培養(yǎng)法濁度與菌量濃度的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，有8例樣本僅有濁度值，而菌量濃度為0 CFU/mL；進(jìn)一步將上述樣本接種于相應(yīng)平板，培養(yǎng)結(jié)果均為陽性?？紤]其可能是中段尿樣本菌量較少，未達(dá)到檢測(cè)閾值或其他樣本內(nèi)在因素導(dǎo)致的。見表3。

表3 UroQuick快速培養(yǎng)法濁度與菌量濃度不符合樣本

3 討論

UTI是兒童常見的感染性疾病之一，由于兒童年齡較小、清潔中段尿樣本取樣較為困難等因素，使得兒童UTI的病原菌檢出陽性率較低。目前針對(duì)兒童細(xì)菌UTI的診斷閾值存在年齡差異[9-10]，準(zhǔn)確判斷清潔中段尿液樣本中病原的菌量對(duì)診斷兒童UTI具有較為重要的意義。然而，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)操作步驟較為繁瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng)，亟需一種快速培養(yǎng)技術(shù)用于UTI的快速診斷。

UroQuick尿液快速培養(yǎng)技術(shù)基于液體培養(yǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)，能在3 h內(nèi)快速檢出清潔中段尿樣本中是否存在細(xì)菌，并明確相應(yīng)的濃度[11]。UroQuick檢測(cè)一般根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線給出濁度值和菌量濃度，本研究以常規(guī)中段尿定量培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)尿液培養(yǎng)陰性組與陽性組濁度和菌量濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且2種方法結(jié)果一致性較好，這與UroQucik僅檢測(cè)活菌生長(zhǎng)，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等其他干擾因素由最初的空白值讀數(shù)消除有關(guān)，也說明無論按照濁度值還是按照菌量濃度計(jì)算，均能有效區(qū)分該樣本中是否存在活菌。進(jìn)一步評(píng)估UroQuick快速培養(yǎng)法診斷UTI的效能，發(fā)現(xiàn)無論按照濁度還是按照菌量濃度計(jì)算，該方法的敏感性均>80%，且對(duì)高濃度菌量的樣本敏感性高于低濃度樣本，但略低于國(guó)外的研究報(bào)道[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，UroQuick快速培養(yǎng)法按菌量濃度計(jì)算診斷UTI的特異性高于按濁度值計(jì)算（92.66%和88.70%），但陰性預(yù)測(cè)值均>90%，提示UroQuick快速培養(yǎng)法快速篩查UTI具有較大的價(jià)值，尤其對(duì)菌量濃度為0的樣本，建議用濁度值作為樣本是否存在病原的判斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究將UroQuick快速培養(yǎng)法與MALDI-TOF技術(shù)相結(jié)合用于細(xì)菌鑒定，發(fā)現(xiàn)UroQuick快速培養(yǎng)法檢測(cè)單一病原菌生長(zhǎng)的報(bào)陽尿液樣本，可在3 h內(nèi)得到陽性結(jié)果，離心取沉淀進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，可在1 h內(nèi)直接鑒定病原到種，2種方法聯(lián)合用于單一生長(zhǎng)的病原檢測(cè)共耗時(shí)4～5 h，明顯縮短了尿液培養(yǎng)的時(shí)間，當(dāng)天即可給予臨床醫(yī)生病原檢測(cè)報(bào)告，有助于臨床醫(yī)生及時(shí)根據(jù)病原種類調(diào)整用藥，控制病情發(fā)展[13]。但該方法不適用于多種細(xì)菌生長(zhǎng)的樣本。

此外，本研究尿液定量培養(yǎng)檢出的58例陽性結(jié)果中，有43例檢出細(xì)菌、4例檢出真菌、11例2種病原均檢出；而UroQuick快速培養(yǎng)法檢出的69例陽性結(jié)果中，有55例檢出細(xì)菌、3例檢出真菌，1例2種病原均檢出；2種方法一致率為86.8%，且對(duì)大多數(shù)常見細(xì)菌（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌）檢出情況較為一致。但仍有31例樣本檢測(cè)結(jié)果不一致，主要有2種情況：（1）針對(duì)部分菌量較低的尿液樣本，由于UroQucik快速培養(yǎng)法檢測(cè)閾值為500 CFU/mL，因此部分濃度較低且常規(guī)定量接種法為陰性的樣本易被檢出；（2）針對(duì)部分多種病原生長(zhǎng)的樣本，常規(guī)定量接種法采用10 μL的接種量，會(huì)導(dǎo)致菌量較少的病原被菌量較多的病原掩蓋，常規(guī)方法無法區(qū)分，而UroQuick快速培養(yǎng)法加入500 μL進(jìn)行孵育，使得部分多種病原生長(zhǎng)的樣本更容易被檢出。建議采用UroQuick快速培養(yǎng)法檢測(cè)細(xì)菌濃度較低的中段尿樣本時(shí)結(jié)合尿常規(guī)或患者臨床癥狀來確定其是否為感染病原菌。本研究中，UroQuick快速培養(yǎng)法未檢出尿液樣本中含有的銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、皮氏不動(dòng)桿菌，3例樣本分別培養(yǎng)為陰性、奇異變形桿菌和2種細(xì)菌生長(zhǎng)，綜合3例患兒的尿常規(guī)情況，考慮可能是在菌量濃度較低或操作過程中有污染。由于UroQuick快速培養(yǎng)法的原理是基于激光散射技術(shù)，根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)特性，分別從30°和90° 2個(gè)方向采集細(xì)菌顆粒的散射光，并采用非線性最小二乘擬合的算法計(jì)算出原樣本中的細(xì)菌濃度，所以存在以下問題：（1）該方法尚無法區(qū)別感染菌與污染菌，對(duì)多種病原生長(zhǎng)的尿液樣本的診斷意義仍有待進(jìn)一步探討[13]；（2）UroOucik快速培養(yǎng)法僅給出尿液樣本中細(xì)菌的濁度值和濃度值，無法檢測(cè)尿液中的白細(xì)胞，建議在使用該方法時(shí)結(jié)合尿常規(guī)結(jié)果綜合判斷；（3）本研究設(shè)定的UroQuick快速培養(yǎng)法的最低檢測(cè)限為500 CFU/mL，當(dāng)尿液樣本較渾濁，且菌量較少時(shí)，可能會(huì)影響病原的檢出，建議對(duì)此類樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以減少蛋白或白細(xì)胞等因素的影響。

綜上所述，UroQuick快速培養(yǎng)法可作為一種新的尿液快速培養(yǎng)技術(shù)，無論按照濁度結(jié)果還是菌量濃度結(jié)果計(jì)算均具有較好的特異性和陰性預(yù)測(cè)值，可用于兒童UTI的早期篩查。此外，UroQuick檢測(cè)法3 h即可得到細(xì)菌濃度的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定技術(shù)可直接對(duì)報(bào)陽后的樣本（單一細(xì)菌生長(zhǎng)）進(jìn)行細(xì)菌鑒定（種），縮短了清潔中段尿液樣本的培養(yǎng)時(shí)間，為兒童UTI提供快速的病原學(xué)診斷依據(jù)，未來若能將快速培養(yǎng)技術(shù)與藥物敏感性試驗(yàn)相結(jié)合，也能在一定程度上縮短藥物敏感性試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間，有助于兒童UTI的早期診療。