冀 葉，袁小筍， 張 蕾， 馬慧利， 薛永飛， 李長生， 張敬偉， 任中海， 張騰飛

（1. 南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科二病區(qū)，河南 南陽 473000；2. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤一病區(qū)，河南 鄭州 450001）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，好發(fā)于女性，近年來發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1]。乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）約占全部甲狀腺癌的80%～90%[2]。多數(shù)PTC患者預(yù)后良好[3]，但由于PTC起病隱匿、早期易轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致仍有部分患者預(yù)后不良，甚至死亡[4]。因此，深入探討PTC的發(fā)病機(jī)制，尋找與其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)的敏感基因，對(duì)患者早期診療及預(yù)后改善意義重大。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度在200 nt以上的RNA，可通過多種途徑參與調(diào)控惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程[5]。肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（highly up-regulated in liver cancer，HULC）是新近發(fā)現(xiàn)的1種lncRNA，在肝細(xì)胞肝癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤[8]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。目前，關(guān)于HULC與PTC的研究較少。為此，本研究擬分析PTC組織中HULC的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，并通過干擾人PTC細(xì)胞株TPC-1中HULC的表達(dá)，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲的影響，以期為PTC的致病機(jī)制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月—2019年12月在南陽市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的PTC患者105例，其中男31例、女74例，年齡21～72歲。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期68例、Ⅲ～Ⅳ期37例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。術(shù)中留取PTC組織及距離腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁組織（經(jīng)病理學(xué)檢查排除癌變可能），快速置于液氮中冷凍，-70 ℃保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初次手術(shù)，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診為PTC；（2）術(shù)前未接受任何治療；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者；（2）繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌患者；（3）合并其他甲狀腺疾病患者；（4）妊娠或哺乳期女性。本研究經(jīng)南陽市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 Trizol試劑和Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑購自日本TaKaRa公司。HULC和內(nèi)參引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。TPC-1細(xì)胞購自上海通派生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素均購自美國Hyclone公司。HULC抑制序列及對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司。StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司），UV1902PC紫外分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司），Stat Fax-2100酶標(biāo)儀（北京天翔飛域科技有限公司）。

1.2.2 癌組織和癌旁組織中HULC表達(dá)的檢測 取癌組織和癌旁組織，剪碎、研磨，加入細(xì)胞裂解液，按總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用UV1902PC紫外分光光度計(jì)檢測純度，以A260nm/A280nm比值>1.80為符合要求。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），并以其為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測HULC的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)。引物序列：HULC上游引物為5'-ACCTCCAGAACTGTGATCCAAAATG-3'，下游引物為 5'-GCCAGGAAACTTCTTGCTT G A-3'；G A P D H上游引物為5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，下游引物為5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算癌組織和癌旁組織中HULC的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 采用含10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃條件下進(jìn)行TPC-1細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，采用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后按2.5×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按轉(zhuǎn)染序列分為si-HULC組（轉(zhuǎn)染HULC的小分子干擾序列5'-AACCTCCAGAACTGTGATCCA-3'）、si-Con組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列5'-CGAGCAGAGACTCTAACATTCTCGC-3'）、空白組（不作任何處理）。處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 TPC-1細(xì)胞中HULC相對(duì)表達(dá)量的檢測 將si-HULC組、si-Con組和空白組細(xì)胞進(jìn)行處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再用胰蛋白酶消化，置于細(xì)胞裂解液中，采用RT-qPCR檢測HULC的表達(dá)情況。操作步驟同癌組織和癌旁組織中HULC表達(dá)的檢測。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 取si-HULC組、si-Con組和空白組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，密度為2.5×105個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。分別在培養(yǎng)12、24、48、72和96 h時(shí)加入10 μL CCK-8，避光孵育3 h，檢測各孔A450nm值。

1.2.6 TPC-1細(xì)胞侵襲能力檢測 取si-HULC組、si-Con組、空白組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，離心留取沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，密度為2.5×104個(gè)/mL，備用。取基質(zhì)膠，提前24 h融化，用無血清培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋后，平鋪在Transwell小室的上室，風(fēng)干備用。取制備的細(xì)胞懸液200 μL，加入Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS沖洗，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，擦除散落的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)高倍鏡視野對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織與癌旁組織中HULC相對(duì)表達(dá)量的比較

PTC組織中HULC的相對(duì)表達(dá)量為2.51±0.19，顯著高于癌旁組織（1.02±0.07）（t=73.776，P<0.001）。

2.2 不同臨床病理特征的PTC患者癌組織中HULC相對(duì)表達(dá)量的比較

腫瘤直徑>2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者的癌組織HULC相對(duì)表達(dá)量分別顯著高于腫瘤直徑≤2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC患者（P<0.05），而不同年齡、性別、病灶數(shù)量和局部侵犯類型PTC患者間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征的PTC患者癌組織中HULC相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 si-HULC組、si-Con組和空白組HULC相對(duì)表達(dá)量的比較

si-HULC組、si-Con組和空白組HULC相對(duì)表達(dá)量分別為0.17±0.05、1.02±0.05和1.00±0.10，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293.672，P<0.001）。兩兩比較，si-HULC組HULC相對(duì)表達(dá)量低于si-Con組和空白組（P<0.05），si-Con組與空白組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 si-HULC組、si-Con組及空白組細(xì)胞增殖活性比較

si-HULC組培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)A值均低于si-Con組和空白組（P<0.05），si-Con組與空白組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 si-HULC組、si-Con組、空白組培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞增殖活性A值比較

2.5 si-HULC組、si-Con組及空白組細(xì)胞侵襲能力比較

si-HULC組、si-Con組和空白組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（84±8）個(gè)、（101±7）個(gè)和（103±7）個(gè)，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.447，P=0.001）。si-HULC組侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-Con組和空白組（P<0.05），si-Con組與空白組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 si-HULC組、si-Con組、空白組細(xì)胞侵襲情況（×200）

3 討論

有研究結(jié)果顯示，部分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移伴局部侵犯的PTC患者會(huì)發(fā)生治療耐受[9]。因此，開展對(duì)PTC發(fā)病機(jī)制及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制或敏感基因的研究具有重要的臨床價(jià)值，可以為PTC的診療提供新的靶標(biāo)。

HULC是一種高度保守的，長度為500 nt的lncRNA，位于人染色體6p24.3，在多種惡性腫瘤組織中呈特異性高表達(dá)[10]，且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[11]及患者臨床結(jié)局[12]密切相關(guān)，下調(diào)該基因表達(dá)可促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中HULC的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織（P<0.001），提示HULC在PTC組織中呈高表達(dá)，可能參與了PTC的發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示，腫瘤直徑>2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者的癌組織中HULC相對(duì)表達(dá)量明顯升高，進(jìn)一步說明HULC可能參與了PTC的發(fā)生、發(fā)展，可能在促進(jìn)腫瘤生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步探討HULC在PTC發(fā)生及進(jìn)展中的作用，本研究采用小分子干擾RNA技術(shù)特異性沉默TPC-1細(xì)胞中HULC的表達(dá)，結(jié)果顯示，si-HULC組HULC相對(duì)表達(dá)量低于si-Con組和空白組（P<0.05），說明轉(zhuǎn)染HULC干擾序列后，si-HULC組TPC-1細(xì)胞中的HULC表達(dá)被抑制。有研究結(jié)果顯示，HULC在腫瘤細(xì)胞惡性增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[14]。本研究結(jié)果顯示，si-HULC組培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)的A值均低于si-Con組和空白組（P<0.05），說明在抑制了HULC的表達(dá)后，TPC-1細(xì)胞的增殖活性明顯降低，提示HULC可能參與了TPC-1細(xì)胞的增殖過程。蘇文等[15]的研究結(jié)果顯示，HULC可增強(qiáng)口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，si-HULC組侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-Con組和空白組（P<0.05），說明抑制HULC的表達(dá)后，TPC-1細(xì)胞的侵襲能力被抑制，提示HULC可能參與了腫瘤細(xì)胞侵襲過程。

綜上所述，PTC組織中HULC表達(dá)量升高，且與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。干擾HULC表達(dá)后可抑制TPC-1細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力。因此，HULC有望為PTC機(jī)制研究及治療靶點(diǎn)選擇提供新的目標(biāo)基因，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。