李 哲，楊寒淞，曹應(yīng)葵，范青飛，李玉葉

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，云南 昆明 650032；2.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐臘 666303）

我國(guó)是抗生素使用大國(guó)，世衛(wèi)組織一項(xiàng)研究表明，我國(guó)住院病人抗生素使用率高達(dá)80.00%［1］，中國(guó)細(xì)菌耐藥率高達(dá)45.00%，遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家，而抗生素濫用帶給人體的傷害也是不可估量的［2］。鑒于全國(guó)各地如此嚴(yán)重的抗生素耐藥狀況，并且抗生素存在多重耐藥以及交叉耐藥的情況下，亟需尋找不同靶點(diǎn)、不同作用機(jī)制的抗菌藥物。大量研究表明中藥的天然產(chǎn)物具有良好的抗菌活性，并可以逆轉(zhuǎn)耐藥，因此我們應(yīng)充分利用中醫(yī)藥寶藏，研究具有抗菌作用的中藥及提取物，為新藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淋球菌ATCC-49226 來源于云南省疾病預(yù)防與控制中心；金黃色葡萄球菌ATCC-12228、光滑念珠菌ATCC-66032、白念珠菌ATCC-14053 來源于昆明醫(yī)科大學(xué)；新型隱球菌ATCC-32045 來源于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.1.2 主要儀器、設(shè)備 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma Scientific 公司；比濁儀、麥?zhǔn)瞎苜?gòu)自中國(guó)珠海迪爾生物工程有限公司；移液器購(gòu)自美國(guó)Eppendorf 公司；生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Labconco 公司。

1.1.3 中藥提取物及其制備

1.1.3.1 提取物 ① 乙醇提取物：紫草素、桂皮醛、巴西蘇木素、竹葉椒、貴州花椒、刺異葉椒、異葉花椒、毛刺花椒、菱葉花椒、滇丹參葉。以上由中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園提供。② 其他提取物：云南紅豆杉、清明花、白鉤藤、兩面針、定心藤、青牛膽、傣百解、黑皮跌打、鴉膽子，以上由中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園提供。③ 茶提取物：茶黃素類、茶褐素類、茶紅素類、咖啡堿類由云南漢德生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3.2 中藥提取物制備方法 ① 乙醇提取物：分別將10 種中藥（紫草、桂皮、蘇木、竹葉椒、貴州花椒、刺異葉椒、異葉花椒、毛刺花椒、菱葉花椒、滇丹參葉）粉碎成粗粉，用95 %的乙醇浸泡3 次，過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓，回收溶劑，得到提取物。上述提取物以無菌生理鹽水 （含5%二甲基亞砜助溶劑） 配成濃度為 1 mg/ml 的溶液作K-B紙片法初篩用。② 其他提取物：分別將9 種中藥（云南紅豆杉、清明花、白鉤藤、兩面針、定心藤、青牛膽、傣百解、黑皮跌打、鴉膽子）粉碎后，用甲醇提取，然后將甲醇提取物溶解在甲醇和水（9：1）的混合溶劑中，用石油醚萃取，得到石油醚提取物。甲醇和水層脫溶后，加水溶解，然后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，上述中藥就得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四個(gè)部位提取物。上述提取物用無菌生理鹽水（含5%二甲基亞砜助溶劑）配成濃度為 1 mg/ml 的溶液作K-B 紙片法初篩用。③ 茶提取物：將普洱茶粉碎成粗粉，加入蒸餾水浸提回流，濾液進(jìn)行一次萃取，得到的有機(jī)相加入氯仿萃取、濃縮，得到咖啡堿類；將水相進(jìn)行二次萃取，得到的有機(jī)相加入正丁醇萃取、濃縮，得到茶紅素類、茶黃素類；將二次萃取得到的水相進(jìn)行三次萃取，得到的水相濃縮蒸干，得到茶褐素類。上述提取物用無菌生理鹽水（含5%二甲基亞砜助溶劑）配成濃度為 1 mg/ml 的溶液作K-B 紙片法初篩用。

1.1.4 培養(yǎng)基 沙氏培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、瓊脂粉購(gòu)于北京酷來搏科技有限公司；淋球菌GC 培養(yǎng)基及Isoviatale X 增菌劑、抑菌劑購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；10%脫纖維新鮮羊血購(gòu)自南京便診生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 K-B 紙片法抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 制備菌懸液 從固體培養(yǎng)基中挑取菌落于液體培養(yǎng)基，置于35℃搖床250 r/min 搖速下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心去上清，加入無菌生理鹽水混勻，校正細(xì)菌懸液濃度至1×108個(gè)/ml。

1.2.1.2 菌液接種 每個(gè)平板各加載菌液250 μl，用無菌棉拭子涂板，用鑷子加載直徑為6 mm 的無菌濾紙片。用移液器吸取10 μl 中藥提取物分別滴入2個(gè)濾紙片的正中心，生理鹽水組為空白對(duì)照，細(xì)菌用氨芐西林為陽(yáng)性對(duì)照，真菌用氟康唑作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.1.3 觀察結(jié)果 在37℃培養(yǎng)箱孵育（20 ～24）h，讀取抑菌圈的直徑，抑菌圈直徑包括紙片的直徑。

1.2.2 肉湯稀釋法檢測(cè)最小抑菌濃度（MIC） 通過K-B紙片法篩選出對(duì)上述有較強(qiáng)抗菌活性的中藥提取物后，根據(jù)CCLSI M27-A3 用肉湯稀釋法測(cè)定植物提取物對(duì)除淋球菌外其他幾種菌的最小抑菌濃度。

1.2.2.1 待測(cè)樣品溶液配制 取100 mg/ml 中藥提取物儲(chǔ)存液，用液體培養(yǎng)基稀釋成8 mg/ml；氨芐西林、氟康唑均用培養(yǎng)基稀釋為8 mg/ml（DMSO 占最終體積的濃度≤2%）。

1.2.2.2 菌懸液制備 取培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)（2-3）代的純菌落制成菌懸液，濃度調(diào)整至1×105-2×105CFU/ml。在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)出真菌濃度，濃度調(diào)整為2×106-5×106CFU/ml。

1.2.2.3 倍比稀釋藥物濃度 取96 孔板，在每行（1-12）號(hào)孔分別加入100 μl 液體培養(yǎng)基，在1 號(hào)孔加入待測(cè)樣品溶液100 μl，混勻后取100 μl 加入2 號(hào)孔，2 號(hào)孔混勻后取100 μl 加入3 號(hào)孔…直至10 號(hào)孔。在（1-11）號(hào)孔分別加入80 μl 配置好的菌懸液，再加20 μl Alamar Blue。第11 號(hào)孔只加菌懸液，第12 號(hào)孔只加培養(yǎng)基。

1.2.2.4 結(jié)果判讀 將96 孔板置于37℃恒溫箱孵育（16-48） h，觀察孔里顏色變化，當(dāng)孔中有菌生長(zhǎng)時(shí)，Alamar Blue 會(huì)由藍(lán)色變?yōu)榧t色，因此最小抑菌濃度應(yīng)為最后一個(gè)顏色為藍(lán)色孔的濃度。

1.3 瓊脂稀釋法檢測(cè)淋球菌MIC 通過K-B 紙片法篩選出對(duì)淋球菌有較強(qiáng)抗菌活性的中藥提取物后，再通過瓊脂稀釋法檢測(cè)提取物對(duì)淋球菌的MIC。提取物用無菌GC 培養(yǎng)基稀釋，每種提取物的濃度梯度設(shè)置為32 mg/ml、16 mg/ml、8 mg/ml……0.25 mg/ml， 在每個(gè)平皿中加入1×107CFU/ml 的細(xì)菌10 μl，試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24h，分別轉(zhuǎn)種GC 瓊脂平板培養(yǎng)基，24 小時(shí)后無細(xì)菌生長(zhǎng)的平皿則為藥物最低濃度。

2 結(jié)果

2.1 K-B紙片法 檢測(cè)50種中藥提取物的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)紫草素、桂皮醛在1mg/ml 濃度下有抑菌活性，其余提取物無抑菌活性（見表1）。判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) M27-A3 方案［3］。

表1 50 種中藥提取物抗菌活性

注：T 表示總提取物，P 表示石油醚萃取物，E 表示乙酸乙酯提取物，B 表示正丁醇提取物，W 表示水提物

2.2 肉湯稀釋法測(cè)MIC 用肉湯倍比稀釋法測(cè)紫草素和桂皮醛對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌的MIC 值，結(jié)果為：紫草素對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為7.81 μg/ml，對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌最小抑菌濃度均為15.625 μg/ml。桂皮醛對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為160 μg/ml，對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌最小抑菌濃度為250 μg/ml，對(duì)新型隱球菌無抑制作用。

2.3 瓊脂稀釋法測(cè)MIC 用瓊脂稀釋法測(cè)紫草素對(duì)淋球菌的最小抑菌濃度為1mg/ml，桂皮醛對(duì)淋球菌無抗菌作用。

3 討論

近年來，隨著各類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌、真菌對(duì)常用抗生素的耐藥性也逐年攀升。我們課題組已發(fā)現(xiàn)云南地區(qū)淋球菌耐藥現(xiàn)狀為：環(huán)丙沙星耐藥率100%、四環(huán)素耐藥率89.9%、青霉素耐藥率89.3%、阿奇霉素耐藥率14.5%，其中多重耐藥株占比73.6%［4］。因此，在現(xiàn)有抗生素對(duì)耐藥菌的治療效果不佳，且研發(fā)新型抗菌藥物難度大、周期長(zhǎng)的背景下，加強(qiáng)對(duì)中藥抗菌活性的研究和開發(fā)，對(duì)解決細(xì)菌耐藥問題具有重要意義。中藥是中華民族的瑰寶，目前，已有大量研究證實(shí)中藥單體、復(fù)方或中藥提取物中的活性成分具有明顯抗菌作用，并已廣泛應(yīng)用于臨床。已被證實(shí)的中草藥抗耐藥菌的作用機(jī)制主要包括消除耐藥質(zhì)粒、影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、抑制細(xì)菌體內(nèi)酶的活性、影響蛋白質(zhì)和核酸的合成、抑制耐藥菌外排泵等［5］。中藥配伍也由于其通過多靶點(diǎn)、多途徑抗菌而具有毒性低、不易誘導(dǎo)耐藥等特點(diǎn)。

紫草是紫草科紫草屬植物，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，有涼血活血、清熱解毒等功效，民間將其外用于外生殖器部位來治療感染。紫草中脂溶性的醌類化合物為其主要活性成分，包括紫草素類及其二聚體、紫草呋喃類、苯醌類等混源萜類化合物。紫草素是1，4－萘醌的烷基化衍生物，化學(xué)式為C16H16O5。近年來隨著對(duì)紫草研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)紫草素具有抗菌、抗炎［6］、抗腫瘤活性［7］，還有抗氧化損傷［8］以及抗病毒［9］作用。本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)紫草素對(duì)金黃色葡萄球菌、淋球菌、白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌均具有抑制作用。先前的研究表明紫草素通過改變白念珠菌的細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+外流，從而發(fā)揮抗白念珠菌的作用。也有研究者發(fā)現(xiàn)紫草素可以改變耐甲氧西林金黃色葡萄球菌肽聚糖的親和力、細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，從而抑制其生長(zhǎng)［10］。桂皮醛又名肉桂醛、苯丙烯醛、桂醛，來源于天然植物桂枝或肉桂中，是從肉桂樹中提取的烯醛類有機(jī)化合物，其化學(xué)分子式 C9H8O。國(guó)內(nèi)外對(duì)桂皮醛的大量藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降糖、抗肥胖等多種藥理活性［11］。本次研究證明了桂皮醛對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌有抑制作用，有研究者發(fā)現(xiàn)桂皮醛直接作用于真菌細(xì)胞膜表面的中藥成分麥角甾醇，改變細(xì)胞的膜完整性、流動(dòng)性、細(xì)胞活力等，從而抑制真菌生長(zhǎng)，除此之外，還發(fā)現(xiàn)桂皮醛對(duì)耐氟康唑的白念珠菌仍有抑制作用［12］。有研究表明亞抑菌濃度的桂皮醛能夠抑制金黃色葡萄球菌的α-溶血素、腸毒素A 和B 的產(chǎn)量，從而抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)［13］。本研究中傣百解、定心藤、白鉤藤、黑皮跌打等藥物是我國(guó)傣族醫(yī)藥的常用藥材，在本次研究中并未發(fā)現(xiàn)其具有抗菌活性，但其藥用價(jià)值仍不可忽視。

紫草素、桂皮醛對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌、光滑念珠菌均有抗菌活性，紫草素對(duì)淋球菌和新型隱球菌也有抗菌作用，可對(duì)藥物研發(fā)提供參考。