楊文博，張傲潔，劉幽燕，李青云

(廣西大學 化學化工學院，廣西 南寧 530004)

蒽醌染料是分子中含有蒽醌結構的各類染料的總稱，現已有400多個品種，約占合成染料總量的20%[1-2]。由于其染色性能佳、易得性好、價格低廉而成為工業(yè)生產的首選染料，在合成染料中具有很重要的地位[3]。蒽醌染料具有3個融合苯環(huán)以及中心環(huán)上有2個羰基的復雜結構，使得該類染料不僅能夠在環(huán)境中穩(wěn)定存在，而且對人體以及其他生物體的毒性高于偶氮染料[4]?；钚运{4(RB4)是蒽醌類染料中的一種，研究表明，100 mg/L的RB4能顯著降低小麥種子的發(fā)芽率(27%)，并且使得根和枝的生長分別減少48%和29%,對人體淋巴細胞和角朊細胞的脫氧核糖核酸(DNA)均有顯著的損傷作用[5]，因此消減蒽醌染料污染對保護生態(tài)環(huán)境安全和人類身體健康非常必要。目前，國內外主要采用物理法和化學法去除蒽醌染料，但是這些方法存在成本高、易產生二次污染等弊端[6-7]。生物吸附法被認為是綠色、價廉的可選策略之一[8-9]，許多真菌物種，如平菇Pleurotusostreatus[10]、煙管菌Bjerkanderaadusta[11]、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum[12]等已被證實能有效脫色蒽醌染料。然而，生物體系在脫色染料的過程中普遍存在吸附劑流失的問題，因此，如何維持體系的生物量對生物法去除染料尤為關鍵。

基于微生物依附生長的特性，將菌株限定生長于載體材料上的固定化技術是有效解決細胞流失的可行方法。盡管現有文獻報道的固定化載體有很多，如活性碳纖維[13]、海泡石[14]、絲瓜絡[15]等，但是只有選用適宜菌株生長的載體材料，才有可能構建獲得生物固載量高且穩(wěn)定性好的生物體系。聚氨酯泡沫(PUF)是一種成本低、力學強度高以及生物相容性好的多孔材料[16-17]。許多研究表明，采用PUF材料對不同種類真菌進行固定化可有效提高生物體系的處理效率[18]。例如：Wang等[19]采用PUF材料固定熱帶念珠菌Candidatropicalis發(fā)酵生產木糖醇，使得木糖醇的產率和體積產量分別達到71.2%和2.10 g/(L·h)。Hama等[20]研究發(fā)現：游離的米曲霉菌Aspergillusoryzae因聚集成菌絲球，導致細胞內部的氧氣和營養(yǎng)物質的可用性受到限制；當采用PUF材料對菌株進行固定化之后，由于菌絲不再聚集成球，促進了氧氣和營養(yǎng)物質的傳質，從而使得固定化細胞分泌的磷脂酶A1是游離細胞的 2倍，因此，大孔結構的聚氨酯泡沫是固定化絲狀真菌的理想載體之一。

本文課題組在前期研究工作中已篩選獲得1株能有效脫色蒽醌染料的黃曲霉菌AspergillusflavusA5p1[21]，并采用PUF材料進行固定化，結果發(fā)現菌株能完全固定生長在PUF材料上，說明PUF材料可作為黃曲霉菌AspergillusflavusA5p1固定生長的良好載體?；诖?，本文以染料RB4為模型底物，進一步研究PUF-固定化生物體系的脫色特性，包括RB4吸附動力學研究、不同RB4質量濃度和鹽度條件(主要以NaCl質量濃度計)對脫色的影響。通過對比黃曲霉菌AspergillusflavusA5p1固定化前后對蒽醌染料RB4的脫色效果以及固定化體系的重復利用批次脫色效果，初步評估PUF-固定化細胞生物體系的可靠性，以期為未來新型染料污染處理工藝的發(fā)展提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：活性藍4(RB4，分析純，上海源葉生物科技有限公司)；聚氨酯泡沫(PUF，凱達新材料有限公司)，密度為(21±1)kg/m3，硬度為55±5(邵氏硬度)，孔徑為60 孔/(25.4 mm)，開孔率為96%；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，分析純，海博生物技術有限公司)；無水乙醇(分析純，西隴化工股份有限公司)；吐溫80(分析純，北京索萊寶科技有限公司)；氯化鈉(分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司)；黃曲霉菌AspergillusflavusA5p1(CGMCC 4292)，由實驗室自行篩選并保存在-80 ℃冰箱中。

儀器：ME204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司)；G1100T型立式壓力蒸汽滅菌鍋(美國ZEALWAY公司)；IQ7000型超純水機(德國Merck Milli-Q公司)；ZHWY-2102型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海智誠分析制造有限公司)；SW-CJ-1BV型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；902型超低溫冰箱(美國Thermo Scientific有限公司)；TS-606-G/4-i型培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；Allegra 25R型臺式高速冷凍離心機(美國BECKMAN COULTER有限公司)；EPOCH2T Microplate Reader酶標儀(美國BioTek有限公司)；50i型正置顯微鏡(日本尼康株式會社)；ALPHA 2-4LSC型冷凍干燥機(德國Christ有限公司)。

1.2 聚氨酯泡沫的預處理

將聚氨酯泡沫用電熱絲切割成1 cm3塊狀，然后用70%乙醇浸洗2次，每次30 min，以去除其他有機物雜質。再用去離子水浸洗2次，每次30 min。最后放置于烘箱，80 ℃烘至恒態(tài)質量。

1.3 生物吸附劑的制備

取出-80 ℃保藏的實驗菌株AspergillusflavusA5p1，接種至滅菌后的PDA培養(yǎng)基(質量濃度為4.6 g/L) 中，于30 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，然后用無菌的0.5%吐溫80溶液洗脫孢子，過濾收集孢子懸液，再次傳代培養(yǎng)至第3代，放置于冰箱，4 ℃保藏備用。

稱取(0.50±0.005 0)g預處理的PUF載體材料進行高壓蒸汽滅菌20 min，取出將其加到滅菌后的基礎培養(yǎng)基中[21]，隨后接入一定量的孢子懸浮液，接種量為8.6×104孢子/mL，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)2 d。用鑷子夾出固定化細胞，用去離子水清洗2次后放入高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，于-45 ℃ 冷凍干燥，待用。

除不放置載體PUF之外，游離細胞的培養(yǎng)條件與固定化細胞的培養(yǎng)條件相同。將培養(yǎng)2 d的游離細胞取出，8 000 r/min條件下離心5 min，去除上層清液，用去離子水清洗細胞2次后在相同條件下滅活，于-45 ℃冷凍干燥，待用。

1.4 染料的吸附動力學

將滅活的PUF-固定化細胞和游離細胞分別投加到100 mL、染料RB4質量濃度為50～700 mg/L的溶液中，在30 ℃、150 r/min的條件下進行吸附實驗。同時，將0.5 g PUF放入錐形瓶中作為對照組，考察載體PUF對RB4的吸附。染料RB4的質量濃度采用分光光度計法測定并計算而得[22]，經過全波段波長掃描，染料RB4的最大吸收波長為599 nm。根據染料RB4的質量濃度標準曲線以及體系的體積可以計算出染料RB4的質量，再由式(1)計算得到載體PUF對染料RB4的實際吸附量：

(1)

式中：Q為PUF對RB4的實際吸附量，mg/g；m0和me分別為體系中RB4的初始質量和吸附平衡時的質量，mg；m1為載體的質量，g。

Langmuir方程、Freundlich方程是研究材料吸附特性常用的經驗式方程。Langmuir方程基于吸附劑表面性質均一、材料為單層吸附的假設；Freundlich方程用于描述均勻表面能量系統(tǒng)的非理想吸附。將載體PUF對不同濃度RB4染料的吸附平衡質量濃度和吸附量等基礎數據，采用Origin Pro.2019軟件對Langmuir方程(見式(2))、Freundlich方程(見式(3)) 進行擬合，建立吸附量和染料吸附平衡時的質量濃度之間的數學關系。

(2)

(3)

式中：Qe為吸附平衡時載體PUF的吸附量，mg/g；Ce為染料吸附平衡時的質量濃度，mg/L；KL為Langmuir常數，L/mg；Qm為PUF的最大理論吸附量，mg/g；KF為Freundlich常數，L/g；n為吸附強度常數。

分別測定PUF-固定化細胞和游離細胞體系對質量濃度為200 mg/L的染料RB4的脫色進程曲線，按照式(4)計算脫色率。同時采用Weber等[23]提出的顆粒內擴散動力學模型進行擬合，顆粒內擴散方程如式(5)所示。

(4)

Qt=Kit1/2+Ci

(5)

式中：D為脫色率，%；A0和At分別為RB4的初始吸光度和脫色t時后的吸光度；Qt為t時的染料吸附量，mg/g；t為吸附時間，min；Ki為顆粒擴散速率常數，mg/(g·min1/2)；Ci是與反應邊界層厚度相關的常數。通常，Ci值越大，邊界層效應越大。

1.5 脫色率測試

分別考察PUF-固定化細胞體系、游離細胞體系對不同質量濃度(100、300、500、700、1 000、1 500、2 000 mg/L)RB4的脫色率以及在不同NaCl質量濃度(1、5、10、20、30、40、50 g/L)條件下脫色的情況。每個樣品做3個平行試樣，在設定的脫色時間點取樣測定體系中染料RB4的吸光度，根據式(4)計算脫色率。游離細胞體系的樣品需先在 8 000 r/min 下離心5 min，然后取上層清液測定吸光度，由式(4)計算得到游離細胞體系的脫色率。

1.6 生物吸附劑重復使用性能測試

以搖瓶實驗模擬染料廢水的批次脫色，將菌株AspergillusflavusA5p1接種至100 mL添加有染料RB4的培養(yǎng)基(染料RB4最終質量濃度為300 mg/L)中，使其固定化生長的同時即實現對染料的吸附。每批次設定時間取出樣品采用分光度計測定染料RB4的吸光度，按照式(4)計算脫色率。脫色結束后取出PUF-固定化細胞再次投入到新鮮配制的RB4溶液中進行下一個批次脫色實驗。批次反應以12 h為1個脫色周期，考察重復使用7個批次的脫色情況。

游離細胞體系的重復使用條件同固定化細胞體系，但是游離細胞在脫色結束后需先在8 000 r/min下離心5 min，然后取出細胞重新投加到下一個批次的脫色實驗。

2 結果與討論

2.1 生物吸附劑對RB4的吸附動力學

首先考察載體PUF對染料RB4的吸附情況。圖1示出載體PUF對RB4的吸附等溫線?？梢钥闯觯琇angmuir方程和Freundlich方程都能較好地描述載體PUF吸附RB4的過程，Langmuir方程具有更高的擬合度，由此認為載體PUF材料對質量濃度為50～700 mg/L的染料RB4的吸附為單分子層吸附，PUF表面吸附位點的性質較為均一。

圖1 載體PUF對RB4的吸附等溫線Fig.1 Adsorption isotherm of RB4 by PUF

表1示出吸附等溫模型的參數擬合結果。可以看出，載體PUF對RB4的最大理論吸附量Qm為3.96 mg/g，與實驗測定的實際吸附量3.35 mg/g較為接近。由Freundlich方程吸附強度常數n大于1可知，載體PUF對染料RB4的吸附較易進行?，F有研究表明，載體PUF對染料的吸附能力與材料的物理化學性質以及染料的特性有關。Silveira等[24]在酸性條件下采用PUF吸附染料直接紅80和活性藍21的最大吸附量分別為4.50、8.31 mg/g，分析認為，載體PUF在酸性介質下帶正電荷，增強了其與陰離子染料之間的靜電作用，使得吸附更易進行。

表1 染料RB4吸附等溫模型的擬合參數Tab.1 Fitting parameters of adsorption isotherm model

分別考察PUF-固定化細胞和游離細胞對200 mg/L染料 RB4的脫色效率，結果如圖2所示。可以看出：PUF-固定化細胞的平衡吸附率為90.5%，20 min內吸附率可達到77.8%；而游離細胞的吸附過程較緩慢，90 min的吸附率僅為62.8%。

圖2 染料RB4的吸附進程曲線Fig.2 Adsorption time curve of RB4

采用顆粒內擴散模型對RB4的吸附過程進行擬合，結果如圖3所示。吸附過程分為3個階段：1)吸附質從主體溶液輸送到吸附劑的外表面；2)吸附質擴散到吸附劑的內表面；3)吸附質擴散到孔的內表面。圖3的直線不通過原點(Ci=0)，說明邊界層的厚度參與了對吸附過程的控制，顆粒內擴散不是吸附過程的唯一限速步驟。

圖3 染料RB4的顆粒內擴散模型Fig.3 Intraparticle diffusion model of RB4

表2示出染料RB4顆粒內擴散模型的擬合參數。在染料向吸附劑外表面擴散的第1階段，PUF-固定化細胞和游離細胞的擴散速率常數Ki1分別為60.7和15.3 mg/(g·min1/2)，反應邊界層厚度相關常數Ci1分別為-132.1和-30.7。Ci1值不為零而為負值，說明此階段的吸附快速發(fā)生在吸附劑的表面，吸附速率主要受界面擴散的影響[25]。從圖3可看出，PUF-固定化細胞可在10 min內快速吸附RB4，這是因為菌株AspergillusflavusA5p1圍繞載體PUF固定生長后，菌絲呈現交織纏繞的形態(tài)，相比于游離細胞的菌絲球形態(tài)，其活性位點增加，從而加快了對RB4的吸附，且載體PUF對染料RB4也有吸附作用，因此，PUF-固定化細胞的宏觀吸附速率明顯快于游離細胞。第2階段為染料逐漸向吸附劑內表面擴散階段，PUF-固定化細胞和游離細胞的擴散速率常數Ki2分別為0.901、5.094 mg/(g·min1/2)。由于PUF-固定化細胞在第1階段達到較高的吸附量，因此隨著RB4濃度的降低和可用吸附位點的減少，PUF-固定化細胞的吸附速率顯著變小，此時的吸附主要受到顆粒內擴散的限制。第3階段為孔內擴散階段，此時達到吸附平衡，PUF-固定化細胞和游離細胞的擴散速率常數Ki3分別為0.041、0.070 mg/(g·min1/2)，二者的擴散速率常數差別不顯著,分析認為載體PUF為大孔結構，染料在載體孔內的擴散可能與其在游離細胞間的孔道擴散相似。Saeed等[26]采用仿絲瓜絡海綿固定綠色木霉Trichodermaviride去除100 mg/L甲基藍，固定化細胞的最大吸附率為84.3%，遠高于游離細胞61.4%的吸附率。研究者認為，仿絲瓜絡海綿能為細胞提供開放的生物結構，增加有效接觸面積，使得固定化細胞的吸附量增加。本文研究也獲得類似的結果，生物吸附劑AspergillusflavusA5p1經過PUF固定化之后對染料RB4的吸附率顯著提高，載體PUF本身對染料RB4的吸附進一步增強了體系的脫色能力，使得該固定化體系的脫色率顯著高于游離細胞體系。

表2 染料RB4顆粒內擴散模型的擬合參數Tab.2 Fitting parameters of intraparticle diffusion model for RB4 adsorption

2.2 生物體系對不同濃度RB4的脫色

染料對生命有機體的毒害作用是限制生物法脫色的關鍵因素之一，因此考察了生物體系對不同濃度RB4的吸附脫色效果，結果如圖4所示?？梢钥闯觯玖腺|量濃度為100 mg/L時，PUF-固定化細胞對RB4的吸附量與游離細胞無明顯差異，但隨著RB4質量濃度的增加，PUF-固定化細胞的吸附量明顯高于游離細胞。當RB4質量濃度為2 000 mg/L時，固定化細胞對RB4的吸附量約為游離細胞的2.5倍，表明PUF-固定化細胞體系可耐受高濃度的RB4染料。Gan等[27]采用桉葉固定洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderiacepacia脫色孔雀石綠(MG)發(fā)現，固定化載體表面的負電荷可促進染料從溶液轉移到細胞活性位點區(qū)域，因此，固定化體系對MG的吸附增強。更多的研究認為載體對微生物具有保護作用，從而可有效減少不良環(huán)境對菌株的毒害。例如：1株斯氏普羅威登斯菌ProvidenciastuartiiPL4經過PUF固定化之后可在120 h內降解2 500 mg/L的苯酚，而游離細胞僅能降解質量濃度為150 mg/L的苯酚[28]，展示出PUF-固定化細胞體系在處理高濃度污染物方面的優(yōu)勢。本文研究中的PUF-固定化細胞體系對高濃度RB4也具有良好的吸附能力，菌體吸附與載體吸附的協(xié)同作用強化了PUF-固定化細胞體系對染料RB4的吸附脫色。

圖4 生物體系對不同質量濃度RB4的脫色Fig.4 Decolorization of RB4 at different concentrations by biological systems

2.3 NaCl質量濃度對生物體系的脫色影響

典型的活性染料染色工藝常添加60～100 g/L的無機鹽[29]，產生的染料廢水所含無機鹽的質量分數高達15%～25%，組分主要是NaCl，少量Na2SO4、KCl以及其他金屬鹽[30]。高鹽條件(以NaCl 質量分數大于3.5%計)會嚴重抑制微生物的活性或者導致細胞質壁分離、活性完全喪失，對生物處理過程非常不利[31]，因此脫色染料廢水的微生物需要有一定的耐鹽性。圖5示出生物體系在不同NaCl質量濃度條件下的脫色效果。

圖5 生物體系在不同NaCl質量濃度條件下的脫色Fig.5 Decolorization of RB4 by biological systems at different concentrations of NaCl

從圖5可以看出，NaCl質量濃度為1～10 g/L時對 PUF-固定化細胞體系的脫色影響不顯著，游離細胞體系的脫色率則隨NaCl質量濃度的增加而顯著下降。當NaCl質量濃度為10、50 g/L時，PUF-固定化細胞仍然保持較高的活性，RB4的脫色率分別為94.5%、75.2%，而游離細胞的脫色率僅為66.1%、49.6%。NaCl質量濃度為10 g/L是游離細胞體系的分界點，此質量濃度下的脫色率減少程度最大，繼續(xù)提高NaCl的質量濃度，脫色率的減小程度趨于平緩，說明細胞表面的活性官能團在10 g/L的NaCl質量濃度下可能被破壞而完全失活，體系脫色率的降低受細胞結構破壞和活性降低的共同影響。與游離細胞體系相比，PUF-固定化細胞體系對高鹽條件表現出良好的耐受性，這可能與固定化載體的保護作用有關[28,32]。Yuan等[33]報道陶粒固定化厭氧微生物可以在5%的NaCl用量下使3種偶氮染料脫色，固定化細胞體系的平均脫色率比游離細胞體系高2.5倍。本文研究中的PUF-固定化細胞體系在NaCl質量濃度為50 g/L條件下的脫色率約是游離細胞體系的1.5倍，表明PUF-固定化AspergillusflavusA5p1在處理含鹽染料廢水方面具有巨大潛力。

2.4 生物體系重復批次脫色效果

重復利用性是固定化技術的顯著優(yōu)勢之一，由于生物吸附劑經過固定化之后細胞不易流失，因此它可以反映生物體系的穩(wěn)定性。圖6示出PUF-固定化細胞體系和游離細胞體系對300 mg/L 染料RB4脫色的重復批次情況。以菌株AspergillusflavusA5p1的固定化生長和脫色作為第Ⅰ個批次，結果表明，菌株AspergillusflavusA5p1完成固定化生長和染料RB4的吸附脫色過程需要36 h，菌株固定化生長時間的長短與接種量、培養(yǎng)基組成等條件有關[34-35]。與PUF-固定化細胞體系相比，36 h時游離細胞體系的RB4剩余質量濃度為49.9 mg/L，脫色率只達到83.3%，這可能是因為培養(yǎng)基中添加染料RB4之后對細胞生長有抑制作用，使得菌株生長較緩慢而導致脫色不完全。通常而言，吸附劑吸附飽和之后需要進行解吸再生才能再次吸附，但是在第Ⅱ個批次實驗中，PUF-固定化細胞和游離細胞體系仍然具有脫色能力，PUF-固定化細胞體系12 h時的RB4剩余質量濃度為1.42 mg/L，脫色率高達99.5%。初步研究發(fā)現，菌株AspergillusflavusA5p1能夠降解RB4，生物降解作用使得吸附劑得以再生，從而有利于吸附脫色過程的持續(xù)進行。隨著重復使用批次的增加，生物吸附劑的流失會導致脫色率降低。從圖6可見，游離細胞體系重復使用至第Ⅶ批次時，RB4的剩余質量濃度為76.6 mg/L，脫色率下降至74.3%，而PUF-固定化細胞體系中的RB4剩余質量濃度為33.1 mg/L，脫色率仍然能達到89%，反映了固定化體系在生物處理穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢。Mulla等[36]采用PUF、藻酸鈉、藻酸鈉-聚乙烯醇、瓊脂以及聚丙烯酰胺固定微球菌Micrococcussp.strain SMN-1降解15 mmol/L的2-硝基苯，PUF-固定化細胞可重復使用24個周期，其他固定化細胞分別重復使用15、20、12和18個周期。由此可見，PUF材料良好的力學強度和生物固載能力，為生物固定化體系的長效、穩(wěn)定運行提供了有利條件。

圖6 生物體系重復批次脫色結果Fig.6 Repeated batches decolorization of RB4 by biological systems

3 結 論

1)采用聚氨酯泡沫(PUF)載體材料成功構建了黃曲霉菌AspergillusflavusA5p1的固定化生物體系，該體系在20 min時對200 mg/L蒽醌染料RB4的吸附率達到77.8%；與之相比，游離細胞體系在90 min時的吸附率僅為62.8%。生物體系對RB4的吸附脫色過程可以用顆粒擴散模型來描述，PUF-固定化細胞體系主要受界面擴散限制，游離細胞體系同時受界面和顆粒內擴散限制，而載體PUF對RB4的吸附符合Langmuir方程。

2)PUF-固定化細胞體系在RB4質量濃度為100～2 000 mg/L、NaCl質量濃度為1～50 g/L的范圍內均能獲得較高的脫色率，其具有處理高濃度染料廢水、含鹽染料廢水的潛力。

3)PUF-固定化細胞體系重復使用7個批次的脫色率仍然能達到89%，而游離細胞體系的脫色率下降為74.3%，說明PUF載體能有效固定生物吸附劑，從而獲得穩(wěn)定的脫色效果。

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