孫光軍， 潘忠梅， 曹 毅， 桑維鈞， 何世芳， 陸 寧， 陳興江

(1.中國(guó)煙草總公司貴州省公司，貴州貴陽 550004； 2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽 550081；3.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州貴陽 550025)

煙草是一類重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)有 100萬hm的種植總面積。多主棒孢霉()屬于暗色菌科棒孢屬，是一種重要的植物病原菌。由多主棒孢霉引起的棒孢霉葉斑病寄主范圍廣泛，可侵染橡膠、煙草、黃瓜、木槿、蓮藕、草莓、苧麻、茄子等530多種植物，嚴(yán)重威脅農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。棒孢霉侵染煙草葉片在世界范圍內(nèi)于1973年首次報(bào)道，1998年在我國(guó)貴州首次發(fā)現(xiàn)其侵染煙草。受侵染葉片初產(chǎn)生暗綠色小點(diǎn)，周圍褪綠變黃，后發(fā)展為圓形或不規(guī)則形褐色斑點(diǎn)，密集的小斑最終可聯(lián)合為不規(guī)則形的褐色大病斑。條件適宜時(shí)，葉背病斑上覆有褐色霉層。目前，國(guó)內(nèi)煙草棒孢霉葉斑病主要分布于貴州省、廣西壯族自治區(qū)等煙區(qū)，貴州大部分煙區(qū)均有發(fā)生，常與赤星病混發(fā)，高濕時(shí)流行速度比赤星病更快，局部區(qū)域危害較重。大量孢子是研究多主棒孢菌致病機(jī)制等的基礎(chǔ)，因此研究多主棒孢霉的產(chǎn)孢適宜條件具有重大意義。Onesirosan等研究了棒孢霉產(chǎn)孢因素得出，當(dāng)培養(yǎng)3 d后首先刮擦培養(yǎng)物，后在連續(xù)光照下再培養(yǎng)3 d，孢子大量增多。關(guān)國(guó)經(jīng)等研究得出，在PDA培養(yǎng)基上27.5 ℃、光照和保濕培養(yǎng)，煙草棒孢病菌產(chǎn)孢較多。后關(guān)國(guó)經(jīng)等于2006年得出，烤煙棒孢霉葉斑病菌產(chǎn)孢最適溫度是25～30 ℃。裴月令等研究得出，光暗交替或連續(xù)光照適于煙草棒孢菌產(chǎn)孢。譚海文等的研究顯示，30 ℃、碳氮源分別為乳糖和硝酸鉀及完全黑暗等條件最有利于烤煙棒孢菌分生孢子形成。番華彩等研究得出，香蕉棒孢霉葉斑病病原菌在玉米粉培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高。目前，對(duì)煙草棒孢霉葉斑病病原菌產(chǎn)孢量的研究主要集中在溫度光照等，未進(jìn)行一定的誘導(dǎo)產(chǎn)孢試驗(yàn)，導(dǎo)致以往的產(chǎn)孢方法獲取孢子的量有限，已經(jīng)無法滿足病原菌致病機(jī)制等生物試驗(yàn)的需求。本研究通過對(duì)病原菌在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢量的統(tǒng)計(jì)，尋找產(chǎn)孢量最多的條件，為煙草棒孢霉葉斑病病原菌致病機(jī)制等的試驗(yàn)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

供試菌株：煙草棒孢霉菌株YC1104，登錄號(hào)為MW686731，貴州省煙草科學(xué)研究院保存。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、察氏培養(yǎng)基(Czapek)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

試驗(yàn)時(shí)間：2021年10—11月。

試驗(yàn)地點(diǎn)：貴州省煙草科學(xué)研究院。

1.2 病原菌產(chǎn)孢量影響因素

1.2.1 不同溫度、pH值、誘孢方式對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 選用筆者篩選出的最適產(chǎn)孢的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)和實(shí)驗(yàn)室常用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)進(jìn)行病原菌不同溫度、pH值和誘孢方式的產(chǎn)孢研究。試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)溫度梯度，分別為5、10、15、20、25、28、30、35 ℃。設(shè)置PSA 培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基8個(gè)pH值梯度，pH值分別為 4、5、6、7、 8、9、10、11。培養(yǎng)基pH值用1 mol/L 的HCl溶液和1 mol/L 的NaOH溶液調(diào)節(jié)。

不同誘孢方式試驗(yàn)參照王靜等的辦法，設(shè)置為：T1，光照培養(yǎng)，即晝夜光照培養(yǎng)(全光照)；T2，暗培養(yǎng)，即晝夜無光培養(yǎng)(全黑暗)；T3，12 h光照培養(yǎng)與 12 h 黑暗培養(yǎng)交替進(jìn)行(12 h光暗培養(yǎng))；T4，12 h 近紫外光照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)(12 h紫暗交替)；T5，將健康離體煙葉洗凈，剪成2 cm×2 cm長(zhǎng)的方塊，121 ℃ 高壓滅菌20 min冷卻后，置于接種的菌餅表面，暗培養(yǎng)(煙塊+全黑暗)；T6，將健康離體煙葉洗凈，剪成2 cm×2 cm長(zhǎng)的方塊，121 ℃ 高壓滅菌20 min冷卻后，置于接種的菌餅表面，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)(煙塊+12 h紫暗交替)；T7，將6 mm菌餅接種于9 cm直徑培養(yǎng)基 28 ℃ 暗培養(yǎng)5 d后，用無菌牙簽分別劃傷菌落表面3刀，繼續(xù)暗培養(yǎng)(物理劃傷3刀)；T8，將6 mm菌餅接種于9 cm直徑培養(yǎng)基28 ℃ 暗培養(yǎng)5 d后，用無菌牙簽分別劃傷菌落表面5刀，繼續(xù)暗培養(yǎng)(物理劃傷5刀)。每處理3次重復(fù)，28 ℃ 培養(yǎng)。

接種9 d后拍照記錄菌絲生長(zhǎng)情況，接種11 d后，每皿用10～40 mL無菌水洗滌培養(yǎng)基表面且刮下所有菌絲體于 50 mL離心管中，晃動(dòng)懸浮液 1 min，每皿每次取5 μL懸浮液，共取3次，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢記錄孢子數(shù)。

1.2.2 不同碳源、氮源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以蔗糖及等量替換的山梨醇、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉、果糖、乳糖和麥芽糖為碳源；分別以硝酸鈉及等量替換的牛肉浸粉、丙氨酸、氯化銨、甘氨酸、尿素、蘇氨酸和蛋白胨為氮源，配制成不同碳氮源的培養(yǎng)基。對(duì)照為不加碳氮源的培養(yǎng)基，分別將6 mm菌餅置于培養(yǎng)基皿中央，28 ℃ 暗培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，方法同“1.2.1”節(jié)記錄孢子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度、pH值、誘孢方式對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表1、圖1～圖6可知，在PSA培養(yǎng)基上，不同溫度下病原菌產(chǎn)孢量有顯著差異。5 ℃ 時(shí)病原菌不產(chǎn)孢，在10～30 ℃ 溫度下，病原菌產(chǎn)孢逐漸增多，在30 ℃ 時(shí)產(chǎn)孢量最多，溫度達(dá)35 ℃ 時(shí)產(chǎn)孢量較30 ℃ 明顯減少。不同pH值條件下病原菌產(chǎn)孢量存在差異，當(dāng)pH值為7時(shí)產(chǎn)孢最多，其產(chǎn)孢量顯著多于其他pH值。不同誘孢方式病原菌產(chǎn)孢量差異顯著，T6處理(煙塊+12 h紫暗交替)產(chǎn)孢量最多， 其次是T3處理(12 h光暗交替)、T4處理(12 h紫暗交替)，其他處理差異不大。

表1 PSA培養(yǎng)基上不同溫度、pH值、誘孢方式對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表2、圖7～圖12可知，在PDA培養(yǎng)基上，不同溫度下病原菌產(chǎn)孢量有顯著差異，5、10 ℃時(shí)病原菌不產(chǎn)孢，在15、28 ℃ 溫度下，病原菌產(chǎn)孢逐漸增多，在28 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最多，溫度達(dá)30 ℃ 時(shí)產(chǎn)孢量較28 ℃ 明顯減少，30 ℃后產(chǎn)孢量明顯減少。不同pH值條件下病原菌產(chǎn)孢量存在差異，當(dāng)pH值為6時(shí)產(chǎn)孢最多，其產(chǎn)孢量顯著多于其他pH值。不同誘孢方式病原菌產(chǎn)孢量差異顯著，T6處理(煙塊+12 h紫暗交替)、T4處理(12 h紫暗交替)產(chǎn)孢量顯著多于其他處理。

表2 PDA培養(yǎng)基上不同溫度、pH值、誘孢方式對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

2.2 不同碳源、氮源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表3、圖13～圖15可知，不同碳氮源病原菌產(chǎn)孢量存在顯著差異。當(dāng)碳源為果糖時(shí)， 病原菌產(chǎn)孢最多，其次是蔗糖，再次為麥芽糖和乳糖，無碳源處理產(chǎn)孢最少。當(dāng)?shù)礊橄跛徕c時(shí)，病原菌產(chǎn)孢最多，其次是甘氨酸和蘇氨酸，再次為丙氨酸，尿素產(chǎn)孢最少。

表3 不同碳氮源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

3 討論與結(jié)論

煙草棒孢霉葉斑病病原菌大量產(chǎn)孢是實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)，因此研究病原菌產(chǎn)孢量的影響因素具有重要意義。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示， 病原菌產(chǎn)孢量最多的碳氮源分別為果糖和硝酸鈉，與譚海文等研究最有利于烤煙棒孢霉葉斑病病原菌分生孢子形成的碳氮源為乳糖和硝酸鉀的報(bào)道不一致。在PSA培養(yǎng)基上，溫度30 ℃，pH值7時(shí)最適病原菌產(chǎn)孢，最適誘孢方式為：將健康離體煙葉洗凈，剪成 2 cm×2 cm長(zhǎng)的方塊，滅菌冷卻后，置于菌餅表面，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)。在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃最適病原菌產(chǎn)孢，5、10 ℃ 不產(chǎn)孢，與關(guān)國(guó)經(jīng)等烤煙棒孢霉葉斑病病原菌在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最適溫度為27.5～30.0 ℃，20 ℃ 及以下的各處理產(chǎn)孢很少，10 ℃處理不產(chǎn)孢的結(jié)果相似。最適pH值為6，與梁萍等黃脈爵床多主棒孢菌在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢適宜pH值為4～8的研究結(jié)果類似。最適誘孢方式為將健康離體煙葉洗凈，剪成2 cm×2 cm長(zhǎng)的方塊，滅菌冷卻后，置于菌餅表面，12 h培養(yǎng)光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)。與譚海文等研究在PDA培養(yǎng)基上30 ℃ 完全黑暗條件下最利于產(chǎn)孢的報(bào)道結(jié)果有差異，分析可能與病原菌分離自不同地區(qū)有關(guān)，譚海文等分離自廣西壯族自治區(qū)，而本研究病原菌分離自貴州省。大部分植物上分離得到的多主棒孢霉菌在PDA培養(yǎng)基上光暗交替條件最利于產(chǎn)孢，如黃脈爵床、香蕉、木薯、橡膠等，與本研究光暗交替產(chǎn)孢量顯著多于全光照和全黑暗的結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明煙草棒孢霉葉斑病病原菌產(chǎn)孢影響因素，相同條件下煙草棒孢霉葉斑病病原菌在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)11 d的產(chǎn)孢量比在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量多。在PSA培養(yǎng)基上，最適產(chǎn)孢溫度為30 ℃，產(chǎn)孢量達(dá)2.28×10個(gè)/皿；最適產(chǎn)孢pH值為7，產(chǎn)孢量達(dá)5.03×10個(gè)/皿；最適誘孢方式為將健康離體煙葉洗凈，剪成2 cm×2 cm長(zhǎng)的方塊，121 ℃ 高壓滅菌20 min冷卻后，置于接種的菌餅表面，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)，產(chǎn)孢量達(dá)1.62×10個(gè)/皿。此外，最適病原菌產(chǎn)孢的碳氮源分別為果糖、硝酸鈉，產(chǎn)孢量分別為5.12×10個(gè)/皿、1.68×10個(gè)/皿。