王新廷，李 峰，王永東，張 輝，馬建洪，丁德馨*

(1.南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室； 2.南華大學(xué)極貧鈾資源綠色開發(fā)技術(shù)湖南省重點實驗室)

引 言

鈾是一種重要的戰(zhàn)略資源，也是核能發(fā)電所需要的重要基礎(chǔ)原料。天然鈾的持續(xù)穩(wěn)定供給，對中國核能可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1-2]。因此，鈾礦資源的規(guī)?；_發(fā)將成為長遠(yuǎn)戰(zhàn)略。

微生物原位修復(fù)技術(shù)應(yīng)用的前提是掌握地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，從而為制定修復(fù)計劃提供數(shù)據(jù)支持。為此，本文采用高通量測序技術(shù)獲取了某酸法地浸采鈾退役采區(qū)地下水中微生物多樣性信息，并對該信息進(jìn)行了深入分析，為該酸法地浸采鈾退役采區(qū)地下水微生物原位修復(fù)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 地下水采集與分析

地下水樣采自某酸法地浸采鈾退役采區(qū)地面以下100 m處的含礦含水層。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測鈾濃度，火焰原子吸收分光光度法檢測重金屬離子濃度，離子色譜法檢測陰離子濃度，精密 pH計檢測pH[12]。

1.2 地下水的高通量測序

由于地下水中含有較多的沉積物，因此在取樣前進(jìn)行充分混合。取10 mL混合均勻的地下水樣品，采用Illumina MiseqTM/HiseqTM測序儀對地下水中微生物的16S rRNA和18S rRNA進(jìn)行檢測。

1.3 樣本分析

將Illumina MiseqTM/HiseqTM測序儀得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Sequenced Reads)[13]。首先，根據(jù)overlap關(guān)系將二代測序得到的PE Reads進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后進(jìn)行OTU聚類(ASV去噪)分析和物種分類學(xué)分析[14]。基于OTU聚類(ASV去噪)分析結(jié)果，對OTU(ASV)進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度進(jìn)行檢測；基于分類學(xué)信息，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。在上述分析基礎(chǔ)上，對多樣本的微生物進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)和功能分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 地下水理化性質(zhì)

2.2 微生物樣品測序

由于地下水的pH很低，所以在DNA提取過程中得到的初始DNA濃度低于0.05 ng/μL。在進(jìn)行了2輪PCR擴(kuò)增后，通過2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫質(zhì)控，獲得均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù),然后使用Qubit 3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定。

測序共獲得39 925條16S rRNA基因序列，有效基因序列32 985條，平均長度為458.29 bp，最短的為92 bp，最長的為504 bp;樣本聚類為246個OTUs。獲得的18S rRNA基因序列共35 510條，有效基因序列32 025條，平均長度為454.64 bp，最短的為44 bp，最長的為511 bp；樣本聚類為66個OTUs。

2.3 微生物物種豐富度及均勻度

根據(jù)樣本的各類信息構(gòu)建地下水流動相中微生物多樣性的稀釋曲線(Rarefaction curve)，其可以反映樣本的取樣深度，結(jié)果如圖1、圖2所示(每條曲線代表一個樣本)。由圖1、圖2可知：2條曲線最后都趨于平緩，說明本次測序試驗的數(shù)據(jù)量足夠。

圖1 16S rRNA Alpha指數(shù)稀釋曲線

圖2 18S rRNA Alpha指數(shù)稀釋曲線

通過構(gòu)建Rank Abundance曲線對2組樣品中的物種豐富度及均勻度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3、圖4所示(每條曲線對應(yīng)一個樣本)。由圖3、圖4可知：相對于18S rRNA而言，16S rRNA樣品的OTU Rank值范圍更大，說明16S rRNA樣品的物種組成更為豐富；曲線更平緩，說明物種分布更均勻。因此，在該酸法地浸采鈾退役采區(qū)中，細(xì)菌群落相較于真菌群落的物種組成豐富度更高，均勻性更好。

圖3 16S rRNA Rank Abundance曲線

圖4 18S rRNA Rank Abundance曲線

2.4 微生物多樣性分析

對地下水中微生物的多樣性指數(shù)進(jìn)行評估，結(jié)果如表1所示。OTUs、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)與Simpson指數(shù)均用來評估微生物多樣性，OTUs越大，Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明群落多樣性越高[15]。由表1可知：該地下水中細(xì)菌群落的多樣性明顯高于真菌群落的多樣性。

表1 樣品中微生物多樣性指數(shù)評估結(jié)果

地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)如表2、圖5和圖6所示。由表2、圖5和圖6可知：16S rRNA測序所得的優(yōu)勢菌門種類有變形菌門(Proteobacteria，67.23 %)、擬桿菌門(Bacteroidetes，13.90 %)、厚壁菌門(Firmicutes，13.15 %)、放線菌門(Actinobacteria，1.52 %)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria，1.41 %)。18S rRNA 測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌門種類主要有子囊菌門(Ascomycota， 89.26 %)、鏈球菌門(Streptophyta，7.53 %)。

圖5 16S rRNA優(yōu)勢物種相對豐度餅圖

圖6 18S rRNA優(yōu)勢物種相對豐度餅圖

2.5 FAPROTAX分析

FAPROTAX分析結(jié)果如表3所示。由表3可知：樣本中的微生物類型主要為甲基營養(yǎng)型、甲烷營養(yǎng)型、硫酸鹽呼吸型、甲醇營養(yǎng)型。研究結(jié)果為后續(xù)微生物原位修復(fù)地下水時，添加到環(huán)境中碳源的選擇提供理論數(shù)據(jù)支持。

表3 FAPROTAX數(shù)據(jù)庫預(yù)測的菌群功能ID

3 結(jié) 論

1)高通量測序結(jié)果表明，該酸法地浸采鈾退役采區(qū)地下水中微生物既有細(xì)菌，也有真菌，且細(xì)菌群落的多樣性明顯高于真菌群落的多樣性。

2)該酸法地浸采鈾退役采區(qū)地下水中的細(xì)菌以變形菌門為主，占比達(dá)67.23 %，而真菌以子囊菌門為主，占比達(dá)89.26 %。

3)該酸法地浸采鈾退役采區(qū)地下水中的微生物類型主要為甲基營養(yǎng)型、甲烷營養(yǎng)型、硫酸鹽呼吸型、甲醇營養(yǎng)型。