劉曉紅,張瑩杰

(太原學(xué)院 藝術(shù)設(shè)計(jì)系,山西 太原 030032)

0 引言

植物組織培養(yǎng)是以植物細(xì)胞具有全能性這一原理為基礎(chǔ),在人為創(chuàng)造的無(wú)菌環(huán)境下，將從植物體中分離得到的各種器官、組織、細(xì)胞等外植體材料，接種到人為提供適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，從而獲得新的組織、細(xì)胞或個(gè)體的技術(shù)[1]。在100多年的發(fā)展歷史中,已經(jīng)有100余科1 000余種植物可以通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行離體快繁[2]。此外,植物組織培養(yǎng)技術(shù)在良種快繁、作物改良、種質(zhì)保存等領(lǐng)域發(fā)揮著很大的作用。草本觀賞植物如石竹、蘭花等[3]通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖或脫毒培育而達(dá)到商品化生產(chǎn);吊蘭、菊花等[4]通過(guò)單倍體育種獲得新型品種。然而在快速發(fā)展的同時(shí),組織培養(yǎng)過(guò)程中也存在著一些一直無(wú)法忽略和攻克的技術(shù)難題,即褐化、玻璃化和菌類污染。三大難題的出現(xiàn)導(dǎo)致外植體材料生長(zhǎng)異常甚至死亡,嚴(yán)重限制了繁殖速度,使其無(wú)法進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn),甚至直接決定了一些植物組織培養(yǎng)的成功與否[5]。

1 褐化現(xiàn)象

褐化指的是外植體材料在離體組織培養(yǎng)的過(guò)程中,從組織切口釋放使培養(yǎng)基變成褐色物質(zhì),導(dǎo)致外植體也隨之失綠變褐直至死亡的現(xiàn)象[6]。

學(xué)者們普遍認(rèn)為組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體褐變主要是由于酶促褐變引起的[7]。由于切割外植體等造成分布在液泡內(nèi)的酚類物質(zhì)與分布在各種質(zhì)體內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶的這種區(qū)域性分布遭到破壞,從而使氧化酶和底物在氧氣的作用下發(fā)生氧化反應(yīng),產(chǎn)生有毒的褐色醌類物質(zhì)。酶、底物和氧化物是酶促褐化必須具備的3個(gè)條件,其中最主要的酶是多酚氧化酶(PPO),最主要的底物是酚類化合物。

酚類物質(zhì)和酶的活性是影響褐化現(xiàn)象的主要原因,因此,降低褐化現(xiàn)象的主要途徑是采取一系列有效抑制酚類物質(zhì)合成和控制酶的活性的措施[8]。

1.1 引起褐化現(xiàn)象的因素

1.1.1外植體

1)植物種類和基因型。植物體內(nèi)含有較高木質(zhì)素、單寧、色素、黃酮等酚類化合物，容易發(fā)生褐變。木本植物比草本植物更易產(chǎn)生褐化[9]。

同種植物不同品種的外植體材料發(fā)生褐變的程度也不盡相同,如周俊輝等[10]通過(guò)對(duì)不同品種觀賞鳳梨的吸芽進(jìn)行防褐研究,結(jié)果表明粉菠蘿褐變程度最嚴(yán)重,然后是水塔花、紅星鳳梨,七彩鳳梨褐變程度最輕。

2)外植體生理狀態(tài)。取幼齡植物的幼嫩部位為外植體材料,其褐變程度遠(yuǎn)低于成齡植物的成熟部位。因?yàn)橛啄鄄牧现兴宇惢衔锖勘瘸墒觳牧现械纳?特別是木質(zhì)素的含量,研究表明剛剛木質(zhì)化或半木質(zhì)化為最佳取材部位[11]。此外,冬春季取材會(huì)比夏秋季取材褐化程度低,如蝴蝶蘭[12]組培夏季取材褐變較重。

1.1.2培養(yǎng)基

1)無(wú)機(jī)鹽種類和濃度。培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的種類和濃度影響褐化,其一是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中一些無(wú)機(jī)物是合成某些氧化酶及其進(jìn)行生理生化的必需元素[13],研究表明Ca2+、Mn2+、Mg2+等金屬離子可能是PPO的激活劑;其二是因?yàn)楦邼舛鹊臒o(wú)機(jī)鹽會(huì)造成外植體材料中的酚類物質(zhì)溢出從而發(fā)生氧化反應(yīng),增加褐化率。如尚旭嵐[14]、馮寧[15]等研究發(fā)現(xiàn)鶴望蘭在1/2MS培養(yǎng)基的褐化率明顯低于MS培養(yǎng)基。

2)培養(yǎng)基硬度。一部分學(xué)者認(rèn)為,液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基更容易解決褐變問(wèn)題,因?yàn)楫?dāng)外植體材料從切口處產(chǎn)生酚類物質(zhì)的時(shí)候,在液體培養(yǎng)基中可以快速擴(kuò)散從而減少對(duì)外植體材料的傷害。如鶴望蘭在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)褐變率較固體培養(yǎng)基低[14]。

3)培養(yǎng)基的pH值。培養(yǎng)基的pH值對(duì)愈傷組織褐變的抑制作用可通過(guò)改變植物體褐變過(guò)程中的酶活性完成。當(dāng)培養(yǎng)基偏堿性時(shí),PPO中的酶蛋白和Cu2+脫離析出,使PPO失去活性,從而減少褐變發(fā)生[6]。低 pH水培并不能抑制朱頂紅鱗莖的褐化,且不利于朱頂紅的生長(zhǎng)與增殖[16]。

4)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。培養(yǎng)基中激素種類、濃度和組合配比都會(huì)影響褐化。BA、ZT、KT等細(xì)胞分裂素會(huì)加速酚類化合物的產(chǎn)生,提高褐化率,而2,4-D、IAA等生長(zhǎng)素會(huì)延緩酚類化合物的產(chǎn)生,降低褐化率[17]。但細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素在合適濃度的配比下不僅可以降低褐化率,還會(huì)促進(jìn)外植體材料的生長(zhǎng)分化,郝捷[18]在卡特蘭愈傷組織繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加3 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA增殖倍數(shù)和褐化率綜合效果最好。

1.1.3抗褐化劑

抗褐化劑可以分為吸附劑、抗氧化劑和螯合劑三大類,三類抗褐化劑的種類和作用機(jī)理如表1所示。

表1 三類抗褐化劑Tab.1 Three kinds of antioxidants

不同草本觀賞植物在組織培養(yǎng)過(guò)程中適合的抗褐化劑種類和防止褐化的效果存在很大差異,抗褐化劑的使用還會(huì)不同程度地影響外植體分化與生長(zhǎng),如廖煥琴[16]研究發(fā)現(xiàn)朱頂紅鱗莖培養(yǎng)基中添加AC 表現(xiàn)出良好的抗褐化作用,且不影響增殖。

1.1.4其他影響因素

適當(dāng)減少培養(yǎng)時(shí)間和增加轉(zhuǎn)瓶時(shí)間會(huì)明顯降低褐變程度,如陳菲等[19]通過(guò)對(duì)蝴蝶蘭15 d,25 d,30 d繼代轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn),隨著轉(zhuǎn)瓶周期的延長(zhǎng),外植體材料由正常生長(zhǎng)到生長(zhǎng)緩慢,色澤從綠色變成暗灰色,培養(yǎng)基也逐漸渾濁。培養(yǎng)溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)會(huì)增強(qiáng)PPO活性,從而加速褐變產(chǎn)生。因此,適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砘蜻M(jìn)行一段時(shí)間的暗培養(yǎng)有助于抑制外植體材料的褐化現(xiàn)象[12,20]。

1.2 防治褐化措施

1)選擇半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化的植物材料做外植體,如一年生植物莖段,莖尖等。

2)在植物休眠期或生長(zhǎng)緩慢的季節(jié)進(jìn)行取材,如早春或者冬季。

3)提前對(duì)外植體材料或者母苗進(jìn)行低溫處理、暗處理或熱激處理。

4)選擇適宜的培養(yǎng)基。

5)在不影響外植體材料正常生長(zhǎng)的前提下,添加適宜種類和濃度的防褐劑。

6)低溫處理或進(jìn)行一段時(shí)間暗培養(yǎng)。

7)適當(dāng)增加外植體轉(zhuǎn)移的周期。

2 玻璃化

玻璃化是指在離體培養(yǎng)過(guò)程中,一些試管苗葉部甚至整個(gè)植株呈現(xiàn)出半透明甚至透明的水漬狀,植株腫大失綠,葉片皺縮翻卷的現(xiàn)象,此類植株也被稱為“玻璃苗”[21]。

2.1 玻璃化產(chǎn)生因素

研究發(fā)現(xiàn),自然界中并不存在玻璃化現(xiàn)象,玻璃化只在組織培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)生[22]。有關(guān)玻璃化形成的原因,普遍認(rèn)為是由于組培苗不適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境,造成外植體體內(nèi)水勢(shì)、激素或以NH4+為主的礦質(zhì)元素供應(yīng)失衡而引起玻璃化發(fā)生[23]。

2.1.1外植體材料

外植體種類會(huì)影響玻璃化的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì),在目前已知的200多種出現(xiàn)過(guò)玻璃化的植物中[24],草本植物比木本植物更容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。此外,外植體大小、生理年齡及取材部位也會(huì)影響玻璃化的發(fā)生,外植體材料生理年齡越小,體積越小,越容易產(chǎn)生玻璃化,通常幼葉>老葉、頂芽>莖中段>莖基部,這可能是由于木質(zhì)化程度稍高的外植體材料里存在某種抗玻璃化物質(zhì)[25]。

2.1.2培養(yǎng)基成分

1)瓊脂和蔗糖濃度。固體培養(yǎng)基可以緩解玻璃化的產(chǎn)生,液體培養(yǎng)基容易造成玻璃化發(fā)生。一方面可能是由于瓊脂中含有K+、Mg2+、Fe2+等物質(zhì),影響著外植體體內(nèi)離子平衡;另一方面是瓊脂和蔗糖維持著培養(yǎng)基的滲透壓,決定著培養(yǎng)基的水勢(shì)差。

2)NH4+。降低NH4+濃度會(huì)明顯預(yù)防外植體材料玻璃化的產(chǎn)生,主要原因是高濃度NH4+會(huì)抑制木質(zhì)素合成的酶,使植株木質(zhì)化程度降低,從而產(chǎn)生玻璃苗。如黃花花[26]等在大花萱草‘黃繡客’的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),隨著NH4NO3含量的減少,玻璃化率降低。

2.1.3培養(yǎng)環(huán)境

研究表明在植物離體培養(yǎng)期間,溫度、光照、透氣性等都間接影響外植體材料玻璃化。

1)光照。增加光照強(qiáng)度和光照時(shí)間有利于減少玻璃苗的發(fā)生,且越接近自然光的光照條件不僅可以明顯降低玻璃化現(xiàn)象,還有利于外植體材料生長(zhǎng),甚至可以通過(guò)自然光照射恢復(fù)一些玻璃苗?？赡苁亲匀还庵械淖贤饩€有利于促進(jìn)外植體材料木質(zhì)化的形成[24]。

2)溫度。研究發(fā)現(xiàn)24～26 ℃是組培最佳培養(yǎng)溫度[27],當(dāng)培養(yǎng)溫度長(zhǎng)時(shí)間超出或低于草本觀賞植物正常生長(zhǎng)的溫度范圍會(huì)引起植物體代謝發(fā)生紊亂,從而造成玻璃化。但也有研究表明適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砘蛟跁円箿夭钶^大的環(huán)境中培養(yǎng)有利于緩解玻璃化現(xiàn)象[28]。

3)透氣性。增加封口材料透氣性主要是為了使培養(yǎng)器皿中的O2、CO2、乙烯達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡、降低培養(yǎng)環(huán)境的相對(duì)濕度從而減少玻璃化現(xiàn)象?！八芰掀?棉塞”[27]是增加透氣性的最佳搭配。

2.2 玻璃化防治措施

玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生是適應(yīng)性的生理問(wèn)題,具有逆向生長(zhǎng)的特點(diǎn)[23]。近些年來(lái)對(duì)于玻璃化的防控措施主要是前期預(yù)防與后期恢復(fù)相結(jié)合,具體可以采取以下措施:

1)采用NH4+的濃度較低的培養(yǎng)基,如B5、NH4+較低的MS 等基本培養(yǎng)基。

2)適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素6-BA的用量,增加干物質(zhì)的積累。

3)降低培養(yǎng)基中的水勢(shì),如采用固體培養(yǎng)基,控制蔗糖濃度。

4)改善培養(yǎng)基的通氣狀況,采用透氣性好的材料做培養(yǎng)容器[29]。

5)在培養(yǎng)基中添加抗玻璃化的物質(zhì),如AgNO3、青霉素、多效唑等。

6)增加自然光照射時(shí)間,最好是在自然光下進(jìn)行培養(yǎng)。

7)熱激處理。

3 菌類污染

污染是指在植物離體培養(yǎng)期間,外植體材料在適宜的環(huán)境中受到細(xì)菌、真菌等微生物的侵染,導(dǎo)致培養(yǎng)基被污染,外植體死亡的一種現(xiàn)象[30]。

3.1 植物組織培養(yǎng)中污染來(lái)源

植物組織培養(yǎng)中的污染按病原可分為細(xì)菌污染和真菌污染兩大類,其特點(diǎn)如表2所示。

表2 細(xì)菌污染和真菌污染Tab.2 Bacterial contamination and fungal contamination

3.2 污染防治

由于細(xì)菌通過(guò)分裂進(jìn)行繁殖,所以當(dāng)培養(yǎng)基受到細(xì)菌污染的時(shí)候,可以通過(guò)采取切除感染部分來(lái)挽救外植體材料;而真菌是靠孢子繁殖,傳播性比較快,所以一旦外植體材料受到真菌污染,需對(duì)污染的種苗進(jìn)行高溫高壓滅菌處理,以防對(duì)環(huán)境造成污染。通?？梢圆扇∫韵麓胧﹣?lái)預(yù)防污染發(fā)生。

3.2.1外植體材料

成年植株生長(zhǎng)環(huán)境越復(fù)雜,帶菌越多,可以將一些易被污染的植物種植在溫室或進(jìn)行水培,采取較幼嫩的部分作為外植體材料;其次最好是在晴朗的中午進(jìn)行取材,強(qiáng)烈的陽(yáng)光可以殺死部分真菌和細(xì)菌。如王安石等[34]在文心蘭組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)晴天上午11:00采摘外植體成活率高,在高溫多雨季節(jié)采摘外植體極易受到污染。另外不同外植體材料所選用的滅菌工序、滅菌試劑和滅菌時(shí)間存在差異,具體植物需要具體分析。

3.2.2無(wú)菌防控

建立無(wú)菌環(huán)境的接種室和培養(yǎng)室,定期用75%(體積分?jǐn)?shù))酒精噴霧或2%(體積分?jǐn)?shù))的新潔爾滅溶液等對(duì)操作室、培養(yǎng)室等進(jìn)行消毒,也可以用紫外線燈照射或甲醛熏蒸消毒,要求操作人員在操作過(guò)程達(dá)到無(wú)菌操作,如在接種時(shí)雙手切勿觸碰外植體材料;進(jìn)入超凈工作臺(tái)前用酒精擦拭雙手;操作人員的著裝進(jìn)行滅菌處理,如戴口罩、無(wú)菌帽,穿無(wú)菌服等。

3.2.3添加抑菌劑

在培養(yǎng)基中添加抗生素可以有效防止污染的發(fā)生,如在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)中添加鏈霉素[35],在竹芋組織培養(yǎng)中添加慶大霉素[36]能夠有效抑制細(xì)菌的產(chǎn)生?？股氐氖褂么龠M(jìn)了組培技術(shù)的新發(fā)展,開(kāi)放式組織培養(yǎng)不僅放寬了對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求,還有效減少污染發(fā)生[37]。然而抗生素是一種極其不穩(wěn)定的物質(zhì),遇高溫易分解[32],所以在組培過(guò)程中不可直接與培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌,需進(jìn)行過(guò)濾滅菌,加大了工作流程,增加了生產(chǎn)成本。此外,長(zhǎng)期使用抗生素不但無(wú)法減輕污染,還會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[37]。

3.2.4新型消毒方法

經(jīng)過(guò)科學(xué)家不斷大膽探索,得到一些新型消毒劑和消毒方法來(lái)進(jìn)一步減少污染的產(chǎn)生。如真空減壓方法滅菌、臭氧消毒、磁力攪拌、超聲振動(dòng)、多次滅菌、多種滅菌劑混合滅菌等方法[38]。

4 結(jié)語(yǔ)

縱觀影響褐變和玻璃化的因素,可以明顯看出褐變和玻璃化的影響因素大同小異,但對(duì)褐變和玻璃化影響程度卻大相徑庭,如木質(zhì)化程度越高的外植體材料越容易發(fā)生褐變卻不易發(fā)生玻璃化;固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基更有利于減輕玻璃化的發(fā)生,對(duì)褐變的影響卻不相同。這可能是由于褐變和玻璃化發(fā)生機(jī)理不同,引起外植體材料體內(nèi)相關(guān)基因、酶、蛋白質(zhì)等發(fā)生相互作用。

采取增加自然光照射、進(jìn)行熱激處理和加大晝夜溫差等措施可以使玻璃苗恢復(fù)成正常苗,今后可以加大對(duì)恢復(fù)玻璃苗的研究,減少玻璃苗的浪費(fèi)。

相對(duì)于褐變和玻璃化,菌類污染主要是由于外界環(huán)境和人員操作不當(dāng)造成的,然而,一旦外植體材料發(fā)生污染現(xiàn)象,外植體材料死亡幾率最大,且遭受真菌污染的外植體材料將無(wú)法再次使用。通過(guò)對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行不斷消毒滅菌、提高操作人員組培技術(shù)來(lái)盡可能減少污染,將污染控制在低水平。除此之外,可以通過(guò)添加抑菌劑或改進(jìn)消毒滅菌的方法來(lái)減少污染發(fā)生,但目前所使用的抑菌劑大都成本較高,長(zhǎng)期使用還可能對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用,所以尋找更加高效無(wú)毒的方法來(lái)代替抑菌劑是非常值得探索的問(wèn)題。

目前有關(guān)對(duì)褐化、玻璃化及菌類污染發(fā)生機(jī)理研究還處在淺層次的分析階段,相信未來(lái)對(duì)造成褐化、玻璃化及菌類污染相關(guān)基因、蛋白、酶及其他分子領(lǐng)域的不斷深入研究,會(huì)從根源上解決三大難題。