聶小琴，董發(fā)勤，劉 寧，劉明學(xué)，張 東，李曉安

1. 西南科技大學(xué)，核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010

2. 綿陽(yáng)市中心醫(yī)院，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)核技術(shù)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621000

3. 西南科技大學(xué)，固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010

4. 四川大學(xué)原子核科學(xué)技術(shù)研究所，輻射物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064

5. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010

6. 中國(guó)工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所，四川 綿陽(yáng) 621900

钚(Pu)作為錒系元素，在兩方面具有獨(dú)特的性質(zhì)，一是5f電子復(fù)雜的成鍵行為，Pu存在6種同素異形體；二是Pu位于Th~Pu (5f電子具有巡回性質(zhì)的輕錒系元素)和Am以后元素(5f電子具有局域性的重錒系元素)之間，同時(shí)具備局域和非局域的性質(zhì).自從1940年P(guān)u被發(fā)現(xiàn)后，由于人為活動(dòng)，目前全球庫(kù)存的Pu總量已超過(guò)2 500 t[1]. Pu以Pu(Ⅲ)、Pu(Ⅳ)、Pu(Ⅴ)、Pu(Ⅵ)幾種不同氧化態(tài)在溶液中共存，其在地下水和工程屏障中的主要化學(xué)形態(tài)為Pu(OH)5?，當(dāng)pH小于5以及Eh值低于?0.5 V時(shí)，Pu主要為+3價(jià)[2]，隨著環(huán)境介質(zhì)的改變，可能發(fā)生氧化反應(yīng)、配位反應(yīng)及水解和沉淀反應(yīng)等，其水溶液化學(xué)行為十分復(fù)雜. 由于Pu是極毒的長(zhǎng)壽命超鈾元素，在中放廢液中對(duì)放射性活度的貢獻(xiàn)最大從而引起廣大科技工作者的廣泛關(guān)注；另外，在核污染場(chǎng)地中，Pu在生物圈中的遷移行為也一直備受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的重視[3-5]. 研究[6-7]表明，超鈾廢物、高中放廢液、放射性核素污染場(chǎng)地(如超鈾核素污染土壤和廢物處置場(chǎng))中賦存的土著微生物具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和耐輻射能力，是超鈾核素(如239Pu等)污染修復(fù)和錒系核素分離的潛在優(yōu)勢(shì)菌種，在放射性廢液錒系核素分離處理中具有較高的應(yīng)用前景. 國(guó)內(nèi)外研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，一些微生物由于其表面的活性基團(tuán)對(duì)錒系元素具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力.傳統(tǒng)的生物吸附是基于代謝非依賴(lài)的物理化學(xué)反應(yīng)的被動(dòng)吸附過(guò)程，而通過(guò)細(xì)胞的代謝活動(dòng)使金屬離子通過(guò)細(xì)胞壁膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的吸收可稱(chēng)為主動(dòng)吸收，把被動(dòng)、主動(dòng)吸收統(tǒng)稱(chēng)為生物積累或生物富集[11-13]. 無(wú)論是活體還是滅活(是否依賴(lài)于代謝活動(dòng))，菌體表面的活性基團(tuán)在吸附反應(yīng)初期都起著十分重要的作用[14-17]，通過(guò)化學(xué)預(yù)處理或表面修飾有助于進(jìn)一步明確生物修復(fù)過(guò)程中微生物表面官能團(tuán)的定性和定量化貢獻(xiàn)[18]，如Garden-Torresdey等[19]研究顯示，藻類(lèi)細(xì)胞經(jīng)酯化處理后對(duì)A13+和Cu2+的結(jié)合能力下降，說(shuō)明羧基在Al3+和Cu2+的吸附過(guò)程中有重要作用；Ashkenazy等[20]的研究表明，乙?；A(yù)處理后提高了菌體對(duì)金屬的吸附量. 近年來(lái)大量研究表明，部分活體微生物(如酵母菌)以在胞內(nèi)外礦化結(jié)晶的形式將鈾等錒系元素富集固定[21-24]，且模擬核素Yb[25]和Ce[26]同樣在微生物界膜處出現(xiàn)礦物晶體. 微生物如何高效原位地修復(fù)放射性污染場(chǎng)地，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者長(zhǎng)期關(guān)注的熱點(diǎn)課題[27-28]. 劉明學(xué)[29]利用有機(jī)酸解吸和濕法消解的方式有效定量區(qū)分了活體微生物對(duì)核素的表面吸附、沉積礦化或胞內(nèi)富集比例，然而關(guān)于滅活和活體微生物對(duì)高中放廢液中主要錒系核素239Pu的富集行為、賦存形式、減量化程度的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[7-9]. 微生物在自然界中大量存在且廣泛分布，研究[30-34]表明，絕大部分微生物對(duì)放射性核素及重金屬的固定具有潛在有效性. 該研究選用模式微生物酵母菌作為代表菌種，通過(guò)化學(xué)預(yù)處理和濕法消解的方式，系統(tǒng)研究微生物對(duì)放射性核素239Pu的富集及減量化行為，以期為高放廢物地質(zhì)處置庫(kù)的核素遷移評(píng)價(jià)及微生物對(duì)錒系核素分離研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：239Pu標(biāo)準(zhǔn)溶液(107Bq/L)以及真實(shí)中放廢液由中核集團(tuán)某公司提供，1 mg239Pu的放射性活度為2.27×106Bq；Hisafe3閃爍液購(gòu)自美國(guó)PE公司；試驗(yàn)所用其他試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純，配置溶液均采用Milli-Q制備；所有放射性試驗(yàn)均在中核集團(tuán)某公司放射性分析室開(kāi)展.

主要儀器：Wallac 1414液閃儀(美國(guó)PE公司)；ORTEC α能譜儀〔50 mm2PIPS (passivated implanted Planar silicon, 離子注入型半導(dǎo)體硅)探頭，美國(guó)ORTEC公司〕；BH1324F低本底多道γ能譜儀(中核北京核儀器廠)；雷磁PHS-3C型精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械十廠)；BS210S電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)；JJ-4A六聯(lián)磁力攪拌器(常州榮華儀器制造有限公司)；DZ-1A真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；KSL-1200X馬弗爐(合肥科晶材料技術(shù)有限公司)；UItra55場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM-EDS，德國(guó)蔡司公司)；IE450型能譜儀(英國(guó)Oxford公司)；Nicolet-5700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)熱電公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)菌體制備方法

模式微生物?酵母菌初始菌株由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院試驗(yàn)中心提供. 液體培養(yǎng)基為葡萄糖50.0 g、尿素1.0 g、(NH4)2SO41.0 g、酵母膏0.5 g、Na2HPO40.5 g、水1 500 mL、pH=4.5. 用電爐加熱并用玻璃棒不斷攪拌配置成1 500 mL溶液. 將活化后的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集活體菌體備用，將部分濕菌體置于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min，然后置于干燥箱中于100 ℃烘至恒干，收集滅活菌體備用.

1.2.2 菌體化學(xué)預(yù)處理方法

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的試驗(yàn)方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g酵母菌濕菌體，分別進(jìn)行脫蛋白、脫脂和脫乙?；?種化學(xué)預(yù)處理：①脫蛋白. 準(zhǔn)確加入20 mL 2 mol/L NaOH溶液，室溫脫蛋白處理24 h后，離心固液分離，用超純水反復(fù)清洗，備用. ②脫脂. 準(zhǔn)確加入20 mL摩爾比為1∶3的乙醇-氯仿混合溶液，室溫脫脂處理24 h后，離心固液分離，用超純水反復(fù)清洗，備用. ③脫乙?；? 準(zhǔn)確加入20 mL 40% NaOH溶液，在115 ℃油浴約4 h后，冷卻，離心固液分離，用超純水反復(fù)清洗，備用.

1.2.3239Pu吸附試驗(yàn)及活度分析

在必要條件下，利用0.1 mol/L HNO3和0.1 mol/L NaOH將一定放射性活度濃度的239Pu溶液pH調(diào)至所需值(該文僅在對(duì)圖1的研究中調(diào)pH，圖2~4的試驗(yàn)pH條件均為標(biāo)準(zhǔn)試劑的原始pH，未經(jīng)調(diào)料，在高pH條件下239Pu的形態(tài)和種態(tài)將發(fā)生較大變化，形成沉淀或膠體，因放射性分析條件有限，難以清晰鑒定和解析其沉淀物相及膠體結(jié)構(gòu)信息)，通過(guò)Fe2+和NO2?調(diào)節(jié)239Pu至+3價(jià)和+4價(jià)，取一定體積的239Pu溶液于25 mL錐形瓶中，加入一定量的酵母菌，置于六聯(lián)磁力攪拌器上，在恒溫、150 r/min下攪拌吸附一定時(shí)間后，4 000 r/min離心20 min，取一定體積(0.1~3 mL)的待測(cè)溶液加入到20 mL聚乙烯閃爍瓶中，然后加入10 mL Hisafe 3閃爍液，搖勻后用液閃儀測(cè)放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算239Pu的放射性活度濃度以及相應(yīng)的吸附率和吸附量. 上述過(guò)程即為批次試驗(yàn). 菌液分離后，為考察菌體對(duì)239Pu溶液的梯次遞降效果，再次向液體中投加新菌體稱(chēng)為梯次吸附(換菌不換液)；為考察菌體的吸附量，再次將吸附過(guò)的菌體投加至未經(jīng)吸附的239Pu溶液中稱(chēng)為累積吸附(換液不換菌).

放射性活度濃度的吸附率(R，%)和吸附量(Q，Bq/g)的計(jì)算公式分別如式(1)(2)所示.

式中：R為放射性活度濃度的吸附率，%；A0為溶液初始放射性活度濃度，Bq/L；A1為溶液殘余放射性活度濃度，Bq/L；Q為放射性活度濃度的吸附量，Bq/g；V0為反應(yīng)溶液的初始體積，L；m為酵母菌的投加量，g.

1.2.4 中放廢液吸附試驗(yàn)及活度分析

準(zhǔn)確移取5 mL中放廢液于25 mL的錐形瓶，加入0.1 g滅活酵母菌，在六聯(lián)磁力攪拌器上攪拌30 min，測(cè)溶液pH(強(qiáng)堿性是因?yàn)榍捌谔幚砉に囂砑哟罅繅A所致，中高放廢液的組分極其復(fù)雜，若調(diào)節(jié)料液將引入更多離子，該文旨在初步探索最簡(jiǎn)化的方式下酵母菌對(duì)廢液中錒系核素的分離潛力，因此未與標(biāo)準(zhǔn)試劑的pH統(tǒng)一)，樣品在4 000 r/min下離心20 min實(shí)現(xiàn)固液分離，取0.1 mL清液稀釋1 000倍，用0.1 mol/L HNO3定容至100 mL后，移取1 mL用于放射性活度濃度〔總α(∑α)、總β(∑β)〕的分析，移取0.2 mL利用ORTEC 8-units system α-spc α能譜儀測(cè)α譜(50 mm2PIPS探頭)，移取1 mL用γ譜儀測(cè)總γ. 其中，γ探測(cè)效率為0.59%，本底計(jì)數(shù)為152，測(cè)量時(shí)間為1 800 s.

采用Wallac 1414液閃儀(具有α/β甄別功能)測(cè)定總α、總β. 放射性活度濃度(A，Bq/L)的計(jì)算如式(3)所示，總α和總β放射性活度濃度〔A(∑α)、A(∑β)，Bq/L〕的計(jì)算公式分別如(4)(5)所示.

式中：cpm為每分鐘計(jì)數(shù)值；cpmw1為總α的每分鐘計(jì)數(shù)值；cpmw2為總β的每分鐘計(jì)數(shù)值；Bc為本底值，其中Bcα=0.8，Bcβ=60；t為計(jì)數(shù)時(shí)間，s；e為探測(cè)效率，其中eα=100%，eβ=65%；V1為分析取樣體積，mL.

樣品中總α放射性活度的分析過(guò)程：準(zhǔn)確移取0.1 mL上清液于5 mL萃取管中，用0.3 mol/L硝酸定容至1 mL，加入1 mL 30% TRPO-二甲苯，充分振蕩萃取5 min，離心分相. 分相后的有機(jī)相用0.4 mol/L硝酸洗滌5 min. 準(zhǔn)確移取0.1 mL洗滌后的有機(jī)相，用液閃譜儀測(cè)量總α放射性活度.

1.2.5 濕法消解

每組設(shè)計(jì)3份平行對(duì)照，試驗(yàn)方法根據(jù)文獻(xiàn)[21]進(jìn)行部分改進(jìn).

絡(luò)合交換：酵母菌與239Pu溶液分離后，其中一份用10 mmol/L EDTA清洗交換5次直至乙二胺四乙酸(EDTA)洗脫液中檢測(cè)不到239Pu，每次清洗，用移液器取2 mL EDTA溶液于5 mL離心管中，輕搖幾次，平放靜置10 min，然后離心將洗脫液轉(zhuǎn)移到10 mL試管中，菌體則保留在原離心管中，如此反復(fù)，直至洗脫完畢；另一份在同樣條件下用超純水清洗作為對(duì)照. 清洗方法如上所述，同樣將交換液儲(chǔ)存在10 mL的試管中，菌體則保留在原離心管中.

濕法消解：用EDTA和超純水洗滌后原離心管中的菌體，以及未經(jīng)清洗的菌體，3份均采用1∶4的高氯酸(HClO4)與硝酸(HNO3)混合溶液5 mL浸泡48 h，進(jìn)行濕法消解，此過(guò)程中輕搖幾次以期與混酸充分接觸使消解更加完全. 消解后，離心將消解液轉(zhuǎn)移到10 mL的試管中，將上述10 mL的試管都用超純水定容到10 mL，測(cè)定239Pu放射性活度. 其中EDTA洗脫下來(lái)的239Pu是酵母菌胞外絡(luò)合的部分，經(jīng)EDTA洗滌后濕法消解出來(lái)的239Pu為在酵母菌細(xì)胞表面礦化穩(wěn)定結(jié)合或進(jìn)入胞內(nèi)的部分. 數(shù)據(jù)處理按式(6)(7)進(jìn)行：

式中：Qcom為單位干質(zhì)量酵母菌中胞外黏附及絡(luò)合的239Pu，Bq/g；CEDTA為EDTA洗脫液中239Pu的放射性活度濃度，Bq/L；Cdigest為混酸消解液中239Pu的放射性活度濃度，Bq/L；Qsta為單位干質(zhì)量酵母菌穩(wěn)定結(jié)合或在胞內(nèi)積累的239Pu，Bq/g；V為EDTA洗脫或混酸消解后溶液體積，L.

1.2.6 零電荷點(diǎn)(pHPZC)滴定方法

將不同質(zhì)量的固體加入到一定量的超純水中，得到一組不同固液比的懸浮液. 隨著固液比的增大，懸浮液體系的pH越來(lái)越接近pHPZC. 分別將0.01、0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、1.10、1.25 g滅活酵母菌加入到20 mL超純水中，在常溫(25 ℃)、150 r/min下振蕩30 h，測(cè)量各溶液的pH.

1.2.7 反應(yīng)前后SEM-EDS和FT-IR分析

酵母菌與239Pu及模擬溶液作用后，4 000 r/min下離心20 min，棄上清液，沉淀物45 ℃烘干備用，利用SEM-EDS和FTIR分別進(jìn)行形貌和表面基團(tuán)分析.SEM的放大倍數(shù)約為20 000倍. FTIR的波數(shù)范圍為4 00~4 000 cm?1.

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌對(duì)239Pu的富集和減量化效果

采用EQ3/6地球化學(xué)模式和模擬計(jì)算發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)239Pu的離子價(jià)態(tài)和種態(tài)有重要影響[2]. 由圖1可見(jiàn)，pH對(duì)滅活酵母菌吸附239Pu的行為有顯著影響，在最適pH=5的條件下，酵母菌對(duì)239Pu的吸附率和吸附量分別為97.32%和0.2×106Bq/g(以干質(zhì)量計(jì)，下同).在pH小于5時(shí)，Pu以+3價(jià)為主，主要是Pu3+[2]，該研究通過(guò)質(zhì)量滴定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母菌的pHPZC為4.54.當(dāng)pHpHPZC時(shí)，酵母菌表面帶負(fù)電荷. pH=5時(shí)，開(kāi)始有Pu(OH)4、Pu(OH)5?和Pu(OH)3+出現(xiàn)；pH=6時(shí)，70%以上為Pu(OH)5?，約20%為Pu(OH)4；pH大于7時(shí)，則基本都以Pu(OH)5?存在[2]. 在pH>5時(shí)，因靜電斥力導(dǎo)致吸附率下降，隨著初始pH繼續(xù)升高，239Pu可能進(jìn)一步水解產(chǎn)生沉淀而降低溶液中239Pu的濃度. 活體及滅活酵母菌對(duì)水體中239Pu的吸附率均在99%以上，吸附239Pu后，580 ℃下灰化處理3 h，菌體可減重97%以上，具有明顯的減量化效果(見(jiàn)表1).

表1 酵母菌對(duì)水體中239Pu的去除效果及灰化減重比Table 1 Removal effect of 239Pu in water and weight loss ratio of ash treatment of S. cerevisiae

圖1 pH對(duì)滅活酵母菌吸附239Pu的影響Fig.1 Effect of pH on 239Pu biosorption by inactivated S. cerevisiae

2.2 化學(xué)預(yù)處理方式對(duì)酵母菌吸附239Pu的影響

為了進(jìn)一步考察酵母菌表面活性吸附位點(diǎn)在吸附239Pu過(guò)程中的作用，對(duì)酵母菌分別進(jìn)行了3種化學(xué)預(yù)處理，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后菌體活性有一定下降. 由圖2可以看出，經(jīng)過(guò)脫蛋白質(zhì)、脫脂和脫乙酰化處理后，酵母菌對(duì)239Pu的吸附率有所影響，脫脂處理后，吸附率略有降低，而脫蛋白質(zhì)和脫乙酰化處理后，經(jīng)過(guò)0.5~24 h的吸附，酵母菌對(duì)239Pu吸附率均低于對(duì)照的1/2，尤其是脫乙?；幚砗?，吸附率僅為對(duì)照的1/4. 這與文獻(xiàn)[18]的結(jié)果一致，脫乙?；幚砗?，啤酒酵母菌及少根霉菌吸附241Am的性能也顯著降低. Ashkenazy等[20]研究表明，乙?；揎棸坊笫筃H3+轉(zhuǎn)變成中性基團(tuán)CH3CO?NHR，從而與帶正電的金屬離子進(jìn)行配位結(jié)合，提高了其對(duì)金屬的吸附量. 這表明乙?；鶊F(tuán)在重金屬和239Pu等錒系核素的吸附過(guò)程中均起到了重要作用，其次是多官能團(tuán)的蛋白質(zhì).

圖2 化學(xué)預(yù)處理方式對(duì)活體酵母菌吸附239Pu的影響Fig.2 Effect of chemical pretreatment on 239Pu biosorption by living S. cerevisiae

2.3 239Pu在酵母菌體內(nèi)的賦存方式

經(jīng)過(guò)EDTA和混酸消解后，不同時(shí)間下活體酵母菌對(duì)胞外絡(luò)合與胞內(nèi)外穩(wěn)定結(jié)合的239Pu的積累量如圖3所示. 由圖3可見(jiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，239Pu酵母菌體內(nèi)的積累量逐步增加，96 h時(shí)，酵母菌對(duì)239Pu的吸附量達(dá)1.56×106Bq/g. 0.5~24 h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，以胞外絡(luò)合和胞內(nèi)外穩(wěn)定結(jié)合兩種方式的吸附量均在增加，單位質(zhì)量酵母菌細(xì)胞壁絡(luò)合239Pu的量在24 h達(dá)到最大，為1.21×106Bq/g，占總吸附量的80.13%. 96 h時(shí)，單位質(zhì)量酵母菌細(xì)胞壁絡(luò)合的239Pu降至1.18×106Bq/g，占總吸附量的75.64%；酵母菌細(xì)胞壁吸附絡(luò)合239Pu的量隨時(shí)間呈先增后減的趨勢(shì)，這與細(xì)胞壁吸附機(jī)理及菌體生長(zhǎng)代謝規(guī)律有關(guān). 利用混酸消解后的239Pu總量一直在增加，表明部分以細(xì)胞壁絡(luò)合的239Pu在該階段進(jìn)入到胞內(nèi)或者礦化為更穩(wěn)定的形式存在. 基于強(qiáng)酸性、化學(xué)毒性和強(qiáng)放射性的條件，推測(cè)24 h后活體酵母菌細(xì)胞壁膜逐漸破損直至活性消亡，因此在該階段進(jìn)入胞內(nèi)的比例進(jìn)一步增加. 由于239Pu與酵母菌細(xì)胞作用時(shí)首先接觸的是細(xì)胞壁，在物理-化學(xué)吸附機(jī)理作用下，細(xì)胞壁在短時(shí)間(0.5 h)即可吸附大量的239Pu (約0.8 Bq/g). 酵母菌細(xì)胞在小劑量輻照及毒害脅迫下具有較高的代謝活性，可能會(huì)利用Ca、Mg或Fe轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道使吸附在細(xì)胞壁上的239Pu向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)一部分，轉(zhuǎn)運(yùn)量的多少與細(xì)胞種類(lèi)、生長(zhǎng)代謝和膜受損狀態(tài)等有關(guān)；同時(shí)，酵母菌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的抗性，使細(xì)胞壁解吸部分239Pu或通過(guò)表面沉積晶化的方式將239Pu轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的礦物形式，表現(xiàn)為穩(wěn)定吸附的239Pu隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增加. 隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐步可能產(chǎn)生適應(yīng)，以及后期細(xì)胞衰退時(shí)細(xì)胞表面暴露出更多的吸附活性基團(tuán)，導(dǎo)致酵母菌細(xì)胞壁表面吸附的239Pu總量緩慢增加直至趨于平衡，這與劉明學(xué)[29]報(bào)道的鍶離子生物吸附規(guī)律相似. 從積累的時(shí)間來(lái)看，與細(xì)胞壁上的絡(luò)合吸附相比，沉積或進(jìn)入胞內(nèi)是一個(gè)相對(duì)緩慢的過(guò)程，這符合酵母菌細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)和吸附積累推測(cè)過(guò)程，即239Pu與酵母菌細(xì)胞接觸后，首先通過(guò)物理化學(xué)吸附在細(xì)胞表面，然后再通過(guò)代謝依賴(lài)或非依賴(lài)機(jī)制向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)或在胞內(nèi)外成核結(jié)晶生長(zhǎng).

圖3 不同時(shí)間下活體酵母菌對(duì)239Pu的積累量Fig.3 Accumulation of 239Pu by living S. cerevisiae at different time

2.4 酵母菌對(duì)239Pu(Ⅲ)和239Pu(Ⅳ)溶液放射性活度的批次及累積吸附

酵母菌在換菌不換液的情況下，對(duì)239Pu(Ⅲ)和239Pu(Ⅳ)溶液的梯次吸附試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示. 由圖4可見(jiàn)，在經(jīng)過(guò)連續(xù)6次吸附后，239Pu(Ⅲ)和239Pu(Ⅳ)溶液的放射性活度濃度從106Bq/L逐漸降至103~104Bq/L，239Pu的吸附率均在99%以上. 滅活酵母菌對(duì)239Pu溶液的吸附性能在前期(前2次累積吸附總量)略?xún)?yōu)于活體，在前面3次吸附中，酵母菌對(duì)239Pu(Ⅲ)的吸附率遠(yuǎn)高于239Pu(Ⅳ)，考慮到溶液初始pH的差異導(dǎo)致Pu在溶液中的種態(tài)不同.239Pu(Ⅳ)溶液的初始pH較低，游離H+較多，這對(duì)239Pu的吸附將造成較大的影響. 在換液不換菌的條件下，經(jīng)過(guò)3次累積吸附，滅活酵母菌對(duì)239Pu(Ⅲ)和239Pu(Ⅳ)的累積吸附量分別可達(dá)0.76×106和0.43×106Bq/g.

圖4 酵母菌對(duì)239Pu(Ⅲ)和239Pu(Ⅳ)溶液放射性活度的梯次遞降結(jié)果Fig.4 The radioactivity result of 239Pu(Ⅲ) and 239Pu(Ⅳ) batch adsorption by S. cerevisiae

2.5 酵母菌與真實(shí)Pu及模擬Ce溶液作用前后的FTIR及SEM-EDS分析

酵母菌與Pu溶液作用24 h的紅外光譜如圖5所示. 酵母菌細(xì)胞壁主要組分是葡萄糖和甘露聚糖，并含有幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì). 由圖5可見(jiàn)，3 411 cm?1附近強(qiáng)寬譜峰為O?H伸展振動(dòng)和N?H伸展振動(dòng)的混合峰，來(lái)自多糖、幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)等組分的貢獻(xiàn).2 959和2 926 cm?1附近的譜峰分別來(lái)自蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的νas(CH2)和νas(CH3)，是典型的脂碳鏈的C?H伸展振動(dòng)吸收帶，它反映脂肪酸、各種膜和細(xì)胞壁組分的親水脂分子的信息. 1 634 cm?1處為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶，來(lái)自C=O伸展振動(dòng). 1 546 cm?1處為酰胺Ⅱ帶，來(lái)自N?H彎曲振動(dòng)和C?N伸展振動(dòng)，這兩處峰是蛋白質(zhì)的特征譜帶.

圖5 酵母菌與239Pu溶液作用前后的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectra of S. cerevisiae before and after interaction with 239Pu solution

1 453和1 405 cm?1附近的吸收帶分別屬于蛋白質(zhì)分子中甲基的反對(duì)稱(chēng)彎曲振動(dòng)峰〔δas(CH3)〕和對(duì)稱(chēng)彎曲振動(dòng)峰〔δs(CH3)〕. 1 385 cm?1處中等強(qiáng)度的吸收歸屬于羧基的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1 238 cm?1處的譜峰為酰胺Ⅲ帶C?N伸展振動(dòng)和N?H彎曲振動(dòng)的混合振動(dòng)峰，可能還有P=O伸縮振動(dòng). 1 047 cm?1處為多糖骨架振動(dòng)吸收帶，主要是糖類(lèi)的C?OH伸縮振動(dòng)，可能也含P?O?C伸縮振動(dòng)[13]. 酵母菌與Pu作用后，3 419 cm?1附近的O?H和N?H伸縮振動(dòng)峰譜帶變寬，酰胺帶和多糖羥基譜峰變化較大，尤其明顯的是，1 384 cm?1處羧基的C?O和C=O特征吸收峰顯著加強(qiáng). 這表明酵母菌與Pu作用時(shí)，羧基、羥基和氨基等活性基團(tuán)的氫鍵被破壞，由C、N、O提供配位電子，與有空軌道的Pu(Ⅳ)或Pu(Ⅲ)以?CO?Pu?、?O?Pu?、?N?Pu?等螯合、絡(luò)合或配位的方式結(jié)合. 由此推斷，酵母菌在吸附Pu的過(guò)程中的確存在化學(xué)吸附過(guò)程，相對(duì)而言，細(xì)胞上的多糖、蛋白質(zhì)酰胺成分更多地參與了對(duì)Pu的吸附過(guò)程.

稀土元素Ce的離子半徑、價(jià)態(tài)及化學(xué)性質(zhì)與Pu等超鈾元素相似，且酵母菌對(duì)Ce的吸附礦化試驗(yàn)研究[26]發(fā)現(xiàn)，酵母菌對(duì)Ce的吸附行為與239Pu非常相似，因此用Ce4+替代239Pu進(jìn)行有關(guān)掃描電鏡和能譜分析是可行的. 酵母菌在25 mg/L的Ce溶液中作用72 h后的SEM-EDS結(jié)果如圖6所示. 在pH=1和pH=3的條件下未發(fā)現(xiàn)明顯的沉積物，在pH=5的條件下，在酵母菌表面發(fā)現(xiàn)有粒徑約100 nm的針狀沉積物，EDS證實(shí)這些沉積物含有Ce，同時(shí)含有較明顯的P和Fe的峰. 推測(cè)在pH=5時(shí)，Ce在酵母細(xì)胞表面與從胞內(nèi)釋放出P結(jié)合，生成Ce的磷酸鹽納米結(jié)晶.

圖6 酵母菌與Ce溶液作用后的SEM-EDS結(jié)果Fig.6 SEM and EDS results of S. cerevisiae after interaction with Ce solution

2.6 酵母菌對(duì)真實(shí)中放廢液錒系核素的梯次遞降

取100 mL真實(shí)中放廢液(由中核集團(tuán)某公司提供，pH=13.4，總α放射性活度濃度為2.64×106Bq/L)于手套箱中，在未進(jìn)行酸度、濃度、活度等任何調(diào)料的前提下，通過(guò)靜態(tài)批次吸附試驗(yàn)，考察酵母菌對(duì)真實(shí)放射性廢液中錒系核素的吸附提取性能，結(jié)果如表2所示. 在中放廢液中，總α放射性活度主要由放射性核素239Pu和241Am提供，從α譜儀分析計(jì)數(shù)得知，吸附前后廢液中239Pu和241Am的計(jì)數(shù)比例均約為10∶1.從表2可以看出，吸附后，溶液從強(qiáng)堿性(pH=13.4)水平逐漸降至弱堿性水平，酵母菌對(duì)真實(shí)中放廢液中的總α放射性活度有較好的去除效果，兩次吸附率分別可達(dá)72.50%和92.74%，吸附量分別達(dá)18 684.11和6 571.35 Bq/g，經(jīng)過(guò)酵母菌2次吸附，總α放射性活度降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)，累積吸附率可達(dá)98%，而總β和總γ放射性活度仍保持原有數(shù)量級(jí)，累積吸附率僅分別為11.45%和6.35%. 這表明利用微生物對(duì)放射性廢液中錒系核素的提取和分離是可能的.

表2 酵母菌對(duì)真實(shí)中放廢液的吸附試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biosorption results of the real middle level radioactive liquid by S. cerevisiae

3 結(jié)論

a) pH=5時(shí)，0.1 g滅活酵母菌對(duì)20 mL放射性活度濃度為1.24×106Bq/L的239Pu的去除可達(dá)97.32%，蛋白質(zhì)和乙酰基團(tuán)對(duì)酵母菌吸附239Pu起到重要作用.

b) 活體酵母菌對(duì)239Pu的吸附是一個(gè)生物、物理、化學(xué)作用相結(jié)合的過(guò)程. 隨著吸附時(shí)間從0.5 h延至96 h，酵母菌積累的239Pu總量逐漸增加，24～96 h期間，絡(luò)合在細(xì)胞表面的239Pu略有降低，而以穩(wěn)定形式賦存在酵母菌細(xì)胞內(nèi)外的239Pu在增加.

c) 通過(guò)Fe2+和NO2?調(diào)節(jié)239Pu至+3價(jià)和+4價(jià)，經(jīng)過(guò)6批次酵母菌吸附(換菌不換液)，239Pu(Ⅲ)放射性活度濃度可從7.35×106Bq/L梯次遞降至2.30×103Bq/L，吸附后的酵母菌經(jīng)灰化處理后，可減量98.21%.

d) 經(jīng)過(guò)酵母菌2次吸附，總α放射性活度濃度降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)，累積吸附率可達(dá)98%，而總β和總γ放射性活度濃度仍保持原有數(shù)量級(jí)，累積吸附率僅分別為11.45%和6.35%. 因此，利用微生物對(duì)放射性廢液中錒系核素的提取和分離是可能的.