柳 麗，李 潔，白羿雄，杜中平，李 屹，陳來生，韓 睿*

1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016

2. 青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016

青稞(Hordeum vulgareL. var.nudumHook. f.)是我國青藏地區(qū)種植面積最廣的糧食作物之一，占該地區(qū)總糧食作物種植面積的43%[1]. 青稞秸稈作為青稞收獲后的副產(chǎn)品，在青海省年產(chǎn)量已達30×104t，資源量十分豐富，但大部分青稞秸稈卻未能得到有效利用，就地填埋和焚燒的現(xiàn)象仍普遍存在，造成極大的資源浪費和環(huán)境污染. 厭氧發(fā)酵是一種有效的有機固廢處理技術(shù)，不僅可以實現(xiàn)秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物減量化，還能生產(chǎn)出清潔能源[2-3]. 然而，直接利用青稞秸稈進行厭氧發(fā)酵卻存在兩個缺點：一是秸稈中緊密的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)嚴重阻礙了底物的水解速度和發(fā)酵效率，二是秸稈過高的碳氮比也會抑制甲烷生成[4-5]. 因此，降低秸稈中木質(zhì)纖維素之間的聚合度、優(yōu)化發(fā)酵系統(tǒng)的碳氮比對于提高青稞秸稈厭氧發(fā)酵性能至關(guān)重要.

預(yù)處理技術(shù)是提高秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物厭氧發(fā)酵效率的有效手段，其中堿法處理是最為高效的預(yù)處理方法之一[6-7]. 相對于其他堿處理試劑，KOH更能夠被回收利用. 例如：Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，KOH預(yù)處理可以顯著提高玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率，并且預(yù)處理過程中添加的大部分K+也能在發(fā)酵液中得到保存；Moset等[9]研究發(fā)現(xiàn)，KOH不僅可以提高麥草的生物降解性，還能提高發(fā)酵液肥料價值. 雖然上述單一KOH預(yù)處理可以提高秸稈的厭氧發(fā)酵性能，但卻無法調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的碳氮比，因此需要補充額外的氮. Wang等[10]指出，在奶牛墊草熱預(yù)處理過程中添加NH3·H2O可以為體系增加氮源，提高甲烷產(chǎn)量；Yuan等[11]發(fā)現(xiàn)，NH3·H2O預(yù)處理具有增加氮含量和調(diào)節(jié)碳氮比等優(yōu)點，有助于提高玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力. 然而，

利用KOH和NH3·H2O聯(lián)合預(yù)處理秸稈類廢棄物的研究鮮有報道. 與單一的堿處理相比，KOH和NH3·H2O聯(lián)合預(yù)處理不僅能夠有效降解秸稈中結(jié)構(gòu)緊密的木質(zhì)纖維素，還能為發(fā)酵系統(tǒng)補充氮源，改善發(fā)酵環(huán)境[10-13]. 此外，預(yù)處理期間添加的K元素和N元素也能夠保留在發(fā)酵后的沼渣沼液中，并可作為鉀肥和氮肥使用，增加土壤肥力，從而減少回收預(yù)處理劑的成本，降低對環(huán)境的污染[14-16].

現(xiàn)階段，秸稈厭氧發(fā)酵的化學(xué)預(yù)處理技術(shù)大多都伴隨著固液分離和廢液排出所帶來的額外成本和環(huán)境污染等問題，極大地限制了秸稈厭氧發(fā)酵的工程化應(yīng)用. 為了在更有效提高青稞秸稈厭氧發(fā)酵性能的同時，能夠進一步降低其對環(huán)境的污染，該研究選用KOH和NH3·H2O對青稞秸稈進行聯(lián)合固態(tài)預(yù)處理，探討不同含量的KOH和NH3·H2O及預(yù)處理時間對厭氧發(fā)酵累積甲烷產(chǎn)量的影響，并通過建立響應(yīng)面模型得到各因素之間的交互作用以及青稞秸稈厭氧發(fā)酵最優(yōu)預(yù)處理條件，同時對比分析最優(yōu)預(yù)處理條件下厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷性能和發(fā)酵液的營養(yǎng)價值，以期為青稞秸稈的資源化利用提供理論依據(jù)和參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青稞秸稈取自青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院實驗地，自然條件下風干后，用粉碎機粉碎至粒徑2 cm左右，于陰涼通風處保存?zhèn)溆? 接種物取自青海知源特色農(nóng)業(yè)有限責任公司以牛糞為原料運行穩(wěn)定的農(nóng)用沼氣池. 接種物取回后，(35±0.5)℃下厭氧培養(yǎng)1~2周至不再產(chǎn)氣以減小背景甲烷產(chǎn)量，將其用作試驗接種物. 發(fā)酵原料和接種物的特性見表1.

表1 原料與接種物特性Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum

1.2 預(yù)處理試驗

前期預(yù)試驗研究發(fā)現(xiàn)，當預(yù)處理時間為24 h時，7% KOH和5% NH3·H2O單一預(yù)處理均能對青稞秸稈厭氧發(fā)酵性能起到較好的提升作用. 進行聯(lián)合預(yù)處理時，考慮到試驗的適用性和可行性，在上述單一預(yù)處理基礎(chǔ)上，以KOH含量(2%、4%、6%)、NH3·H2O含量(1%、3%、5%)和處理時間(12、24、36 h) 3個因素作為聯(lián)合預(yù)處理自變量，預(yù)處理后青稞秸稈厭氧發(fā)酵累積甲烷產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表2. 同時，將7% KOH和5% NH3·H2O單一處理24 h的青稞秸稈(分別記為Q和S)與優(yōu)化條件處理后的青稞秸稈(記為QS)進行對比，并采用未經(jīng)任何處理的青稞秸稈作為對照(記為CK). 上述預(yù)處理系統(tǒng)含水率均設(shè)定在70%左右，將配制好的混合溶液與青稞秸稈充分攪拌均勻后放置在廣口瓶內(nèi)，密封并置于室溫下處理.

表2 試驗因素與水平Table 2 Test factors and levels

1.3 厭氧發(fā)酵試驗

厭氧發(fā)酵試驗采用全自動甲烷潛力測試儀〔MultiTalent 203，碧普華瑞環(huán)境技術(shù)(北京)有限公司〕.將500 mL標準批式進料反應(yīng)器置于恒溫〔(35±0.5)℃〕水浴鍋中，設(shè)定每隔3 min攪拌一次，每次攪拌時長為0.5 min. 預(yù)處理完成后，按照接種物與青稞秸稈的VS接種比為2:1，分別在不同發(fā)酵瓶中加入對應(yīng)含量的青稞秸稈與接種污泥，并設(shè)置只添加接種污泥的空白處理. 各處理組物料添加的總質(zhì)量為400 g，發(fā)酵周期為30 d. 每組均設(shè)置3個重復(fù).

1.4 測定項目及方法

總固體(TS)和揮發(fā)性固體(VS)含量采用烘干法測定，其中，總固體于烘箱105 ℃下烘24 h，揮發(fā)性固體于馬弗爐550 ℃下灼燒3 h；木質(zhì)纖維素含量由纖維測定儀〔F800型，山東海能科學(xué)儀器(中國)有限公司〕參照NY/T 1459?2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》、GB/T 20806?2006《飼料中中性洗滌纖維(NDF)的測定》和GB/T 20805?2006《飼料中酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)的測定》測定；全氮含量采用硫酸-催化劑消解法測定[17]；全磷和全鉀含量分別采用NaOH熔融法-鉬銻抗比色和火焰光度法測定[18]；傅里葉紅外光譜(FTIR)采用固體溴化鉀壓片法進行分析[19].

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS Statistics 22軟件分析數(shù)據(jù)，采用鄧肯多重比較法，當P<0.05時，數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異；利用Design-Expert 12軟件進行數(shù)據(jù)擬合與分析；使用Origin 2018制圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面模型及方差分析

Box-Behnken試驗設(shè)計及其結(jié)果如表3所示. 將青稞秸稈厭氧發(fā)酵累積甲烷產(chǎn)量(Y)設(shè)定為響應(yīng)值，用Design-Expert 12軟件對數(shù)據(jù)進行多元線性回歸擬合，從而得到累積甲烷產(chǎn)量(Y)對KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)、預(yù)處理時間(C)的響應(yīng)面模型：

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及對應(yīng)的試驗結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and test results

由表4可見，響應(yīng)面模型顯著(P<0.05)，但失擬項表現(xiàn)不顯著(P>0.05)，R2=0.949 4，F(xiàn)=14.59，表明該模型能夠?qū)η囡斩挼睦鄯e甲烷產(chǎn)量進行分析與預(yù)測，且擬合效果較好. 由各因素的P值可知，KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)為顯著影響因素，預(yù)處理時間(C)為不顯著影響因素；A、C交互作用顯著，A、B和B、C交互作用不顯著；A2、B2曲面效應(yīng)顯著，C2曲面效應(yīng)不顯著. 由模型一次項及F值可知，各因素對累積甲烷產(chǎn)量的整體影響程度表現(xiàn)為NH3·H2O含量>KOH含量>預(yù)處理時間.

表4 響應(yīng)面模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the response surface model

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

利用Design-Expert 12軟件繪制響應(yīng)面模型的三維曲面圖，考察不同因素之間的交互作用對累積甲烷產(chǎn)量的影響. 由圖1~3可知，在試驗設(shè)定的自變量范圍內(nèi)，KOH含量(A)、NH3·H2O含量(B)、預(yù)處理時間(C)均存在極值點，說明三者范圍設(shè)置比較恰當，擬合曲面的最大值是真實存在的.

由KOH含量和預(yù)處理時間交互作用對青稞秸稈累積甲烷產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖(見圖1)可知，在NH3·H2O含量為3%條件下，當預(yù)處理時間一定時，隨KOH含量的增大，累積甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢. 這說明適宜的KOH含量能夠有效提高青稞秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力，含量過低則產(chǎn)甲烷性能提升效果不明顯，含量過高又可能會抑制微生物活性，影響產(chǎn)甲烷效果[20-21]. 同時，適量的K+也可以刺激產(chǎn)甲烷菌的活性，提高甲烷產(chǎn)量[15]. 當KOH含量一定時，累積甲烷產(chǎn)量隨著預(yù)處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢. 這說明適宜的預(yù)處理時間能夠有效降解秸稈中的木質(zhì)纖維素，有益于產(chǎn)甲烷菌生存；預(yù)處理時間過長則會過度破壞秸稈的有效成分，進而影響纖維素的酶解效率[22]. 從圖1還可以看出，最高累積甲烷產(chǎn)量出現(xiàn)在KOH含量為5%~6%、預(yù)處理時間為12~18 h范圍內(nèi). KOH含量的變化坡度較預(yù)處理時間的變化坡度更陡，曲線越陡說明因素對響應(yīng)值(Y)的影響越大，可見KOH含量較預(yù)處理時間對累積甲烷產(chǎn)量的影響更加顯著.

圖1 KOH含量和預(yù)處理時間交互作用的響應(yīng)面Fig.1 Response surface diagram of interaction between KOH concentration and pretreatment time

由NH3·H2O含量和KOH含量交互作用對青稞秸稈累積甲烷產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖(見圖2)可知，在預(yù)處理時間為24 h條件下，當KOH含量一定時，累積甲烷產(chǎn)量隨著NH3·H2O含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢. 這表明適宜含量的NH3·H2O不僅能夠有效降解秸稈中的木質(zhì)纖維素，還能夠為發(fā)酵系統(tǒng)提供氮源、調(diào)節(jié)碳氮比，促進體系產(chǎn)甲烷性能. NH3·H2O含量過低時不能對青稞秸稈進行有效降解，含量過高則可能會產(chǎn)生氨抑制，影響產(chǎn)甲烷菌活性和發(fā)酵效率[23-24]. 當NH3·H2O濃度一定時，累積甲烷產(chǎn)量隨著KOH含量的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢. 從圖2還可以看出，最高累積甲烷產(chǎn)量出現(xiàn)在KOH含量為5%~6%、NH3·H2O含量在3%~4%范圍內(nèi)；并且當NH3·H2O含量和KOH含量均處于最低水平時，累積甲烷產(chǎn)量亦最低. 同時，NH3·H2O含量的變化坡度較KOH含量的變化坡度更陡，說明NH3·H2O含量對累積甲烷產(chǎn)量的影響更加顯著.

圖2 NH3·H2O含量和KOH含量交互作用的響應(yīng)面Fig.2 Response surface diagram of interaction between NH3·H2O concentration and KOH concentration

由NH3·H2O含量和預(yù)處理時間交互作用對青稞秸稈累積甲烷產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖(見圖3)可知，在KOH含量為4%條件下，當NH3·H2O含量一定時，隨著預(yù)處理時間的延長，累積甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當預(yù)處理時間一定時，累積甲烷產(chǎn)量隨著NH3·H2O含量的升高呈先升后降的趨勢. 從圖3還可以看出，最高累積甲烷產(chǎn)量出現(xiàn)在預(yù)處理時間和NH3·H2O含量分別為12~18 h和3%~4%的范圍內(nèi). NH3·H2O含量的變化坡度比預(yù)處理時間的變化坡度更陡，表明NH3·H2O含量對累積甲烷產(chǎn)量的影響更加顯著.

圖3 NH3·H2O含量和預(yù)處理時間交互作用的響應(yīng)面Fig.3 Response surface diagram of interaction between NH3·H2O concentration and pretreatment time

綜上，NH3·H2O含量對青稞秸稈厭氧發(fā)酵積累甲烷產(chǎn)量的影響較大，這與表4所示方差分析結(jié)果一致. 經(jīng)Design-Expert 12軟件優(yōu)化得到青稞秸稈厭氧發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件為KOH含量5.13%、NH3·H2O含量3.35%、預(yù)處理時間13.87 h，該條件下累積甲烷產(chǎn)量最大預(yù)測值為286.4 mL/g.

2.3 響應(yīng)面驗證試驗

采用最優(yōu)組合條件(KOH含量為5.13%、NH3·H2O含量為3.35%、預(yù)處理時間為13.87 h)進行3次重復(fù)厭氧發(fā)酵試驗，用以驗證響應(yīng)面模型的有效性和準確性. 試驗得到的累積甲烷產(chǎn)量平均值為282.34 mL/g，與預(yù)測值(286.4 mL/g)非常接近，相對誤差小于5%，說明該驗證模型有效.

2.4 對比試驗

2.4.1 日產(chǎn)甲烷量和累積甲烷產(chǎn)量

由圖4(A)可知，在30 d的厭氧發(fā)酵過程中，對照(CK)、單一預(yù)處理(Q和S)和優(yōu)化條件處理(QS)的日產(chǎn)甲烷量均出現(xiàn)1~2個產(chǎn)甲烷高峰，且集中在前10 d，其中QS的日產(chǎn)甲烷量最大，達到154.77 mL，同時能夠快速進入產(chǎn)甲烷階段. 由圖4(B)可知，QS、Q和S處理組累積甲烷產(chǎn)量較CK均顯著增加(P<0.05)，其中QS的累積甲烷產(chǎn)量最高，分別較Q、S和CK提高了7.59%、20.82%和70.78%. 這說明KOH和NH3·H2O聯(lián)合預(yù)處理平衡了發(fā)酵系統(tǒng)的營養(yǎng)成分，更能夠有效提高青稞秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷能力，且所需的含量和時間均低于單一預(yù)處理，更具實際應(yīng)用價值.

圖4 日產(chǎn)甲烷量和累積甲烷產(chǎn)量Fig.4 Daily methane production and cumulative methane production

2.4.2 木質(zhì)纖維組分含量的變化

不同處理組青稞秸稈木質(zhì)纖維素的變化情況如表5所示. 由表5可見，與CK相比，預(yù)處理后青稞秸稈木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量均顯著下降(P<0.05)，

表5 不同處理組木質(zhì)纖維素含量和營養(yǎng)元素含量Table 5 The content of lignocellulose and nutrient elements among different treatment groups

三者去除率分別為23.72%~29.21%、7.81%~10.92%和15.34%~21.31%. 相較而言，木質(zhì)素的去除率最高，這與Liu等[8]的研究結(jié)果相符. 其中，QS處理組的木質(zhì)素去除率分別比Q和S處理組提高了4.25%和8.88%，說明聯(lián)合預(yù)處理的木質(zhì)素降解效果優(yōu)于單一預(yù)處理.

2.4.3 傅里葉紅外光譜圖分析

傅里葉紅外光譜圖(FTIR)是一種能夠表征木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)中基團和化學(xué)鍵的常用技術(shù)手段[25]. 從圖5可以看出，預(yù)處理前后的紅外光譜圖形狀大致相同，說明預(yù)處理后青稞秸稈的官能團及化學(xué)鍵種類沒有發(fā)生變化，僅木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，表現(xiàn)為某些峰的吸收強度不同. 3 475 cm?1附近為羥基(O?H)的伸縮振動峰，代表木質(zhì)素的吸收強度[26]；相比CK，該吸收峰減弱，說明預(yù)處理破壞了木質(zhì)素內(nèi)部的基團，導(dǎo)致秸稈基質(zhì)孔隙度增加. 其中，QS和Q處理組吸收峰減弱明顯，與表5所示木質(zhì)素含量分析結(jié)果一致. 2 913 cm?1附近的吸收峰是由于C?H中甲基和亞甲基對稱及反對稱拉伸振動引起的，代表纖維素的吸收強度[27]；預(yù)處理后該吸收峰減弱，說明在預(yù)處理作用下纖維素中部分甲基、亞甲基發(fā)生斷裂，纖維素降解. 1 724和1 600 cm?1附近分別是羰基鍵和苯環(huán)的吸收峰，代表半纖維素和木質(zhì)素的吸收強度[28-29]；預(yù)處理后兩處吸收峰減弱，表明青稞秸稈中半纖維素和木質(zhì)素得到有效去除. 1 035 cm?1附近的吸收峰是醚鍵的伸縮振動帶，表示半纖維素的吸收強度[28]，此處吸收峰明顯減弱，說明預(yù)處理后半纖維素降解.

圖5 不同處理組的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of different treatment groups

2.4.4 發(fā)酵液的營養(yǎng)元素含量分析

由表5可知，與未添加鉀的處理組(S和CK)相比，添加鉀的處理組(QS和Q)中全鉀含量顯著增加(P<0.05)，增加了23.73%~59.17%，這說明預(yù)處理過程中添加的鉀能夠有效保留在發(fā)酵液中，不會隨著厭氧發(fā)酵的進行而消耗. 添加氨水的處理組(QS和S)中全氮含量比未添加氨水的處理組(Q和CK)顯著增加(P<0.05)，增加了6.43%~37.45%，說明預(yù)處理過程中添加的氮元素也會有效地保留在發(fā)酵液中. 同時，各發(fā)酵液中的全磷含量(6.68~7.82 g/kg)大部分差異不顯著(P>0.05)，因為每個處理組中并未額外添加磷元素. 鉀和氮是增加土壤肥力和促進植物健康生長必不可少的營養(yǎng)元素，在發(fā)酵系統(tǒng)中添加鉀和氮可以有效提高發(fā)酵液的營養(yǎng)價值[30]. 相較于單一試劑處理組，QS處理組保留了鉀和氮兩種營養(yǎng)元素，發(fā)酵液的營養(yǎng)價值更高，具有一定的肥料應(yīng)用潛力. 由于鉀能夠被土壤和植物吸收利用，如果考慮將其發(fā)酵液與肥料配施土壤，不僅能夠減少回收預(yù)處理試劑的成本，還能夠少施化肥，降低成本.

基于此，在僅考慮KOH預(yù)處理成本和發(fā)酵液營養(yǎng)價值條件下對該試驗最優(yōu)處理進行了初步的經(jīng)濟效益分析. 在400 g發(fā)酵體系中，QS處理組KOH消耗量約為0.28 g，即生產(chǎn)1 t發(fā)酵液將消耗KOH 0.7 kg，按KOH市面價格8 000元/t計算，生產(chǎn)1 t發(fā)酵液成本為5.6元. QS處理組發(fā)酵液的全鉀含量高出對照組5.05 g/kg，1 t發(fā)酵液能得到全鉀5.05 kg. 以市面上常見鉀肥?氯化鉀(鉀含量為52.45%)為例，推算得出生產(chǎn)1 t發(fā)酵液相當于能夠得到9.63 kg的氯化鉀. 按氯化鉀市面價格5 200元/t計算，1 t發(fā)酵液能夠產(chǎn)生50.08元的收益，減去前期預(yù)處理的投入成本，則凈收益為44.48元. 相比其他堿處理試劑(如氫氧化鈉)，盡管成本相對較低(氫氧化鈉市面價格為4 700元/t)，但發(fā)酵液中大量存在的鈉離子如果不去除很可能會造成土壤板結(jié)和微生物活性降低等多種問題，危害土壤健康[31-32]，但要去除鈉離子則需要增加額外的回收成本. 綜合考慮經(jīng)濟收益和環(huán)境污染等因素，KOH作為預(yù)處理試劑是可行的.

3 結(jié)論

a) 響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗可以很好地對青稞秸稈累積甲烷產(chǎn)量進行預(yù)測，響應(yīng)面模型顯著(P<0.05)，擬合度高，具有較高的可信度.

b) 方差分析顯示，KOH含量、NH3·H2O含量和預(yù)處理時間三因素對累積甲烷產(chǎn)量的影響程度表現(xiàn)為NH3·H2O含量>KOH含量>預(yù)處理時間.

c) 通過響應(yīng)面模型驗證試驗得到青稞秸稈累積甲烷產(chǎn)量最優(yōu)預(yù)處理條件為KOH含量5.13%、NH3·H2O含量3.35%、預(yù)處理時間13.87 h，該條件下累積甲烷產(chǎn)量實測值為282.34 mL/g，與預(yù)測值(286.4 mL/g)非常接近，相對誤差小于5%，證明驗證模型有效.

d) 對比試驗結(jié)果顯示，KOH和NH3·H2O聯(lián)合預(yù)處理能夠顯著提高青稞秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷能力(P<0.05)，同時能夠有效降解木質(zhì)素(降解率為29.21%)，提高發(fā)酵液營養(yǎng)價值，是高效生產(chǎn)生物甲烷和環(huán)境友好的木質(zhì)纖維素類廢棄物的處理方法.