汪銳 楊穎 龍國賢

(1武漢市第一醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科)

鼻咽癌是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的頭頸部惡性腫瘤，其在我國的發(fā)病率約占全球80%〔1〕。放療是鼻咽癌的首選治療方法，但因部分患者表現(xiàn)出放療抵抗導(dǎo)致其應(yīng)用受限〔2，3〕。因此，深入探討鼻咽癌患者放療抵抗機制，尋找有效提高放療敏感性的方法一直是研究熱點。微小RNA(miRNA)是一類保守的內(nèi)源性非編碼RNA，被證實在鼻咽癌放療抵抗中發(fā)揮著重要作用〔4〕。EB病毒(EBV)感染是鼻咽癌發(fā)病的重要因素，其編碼的miRNAs可通過調(diào)控病毒和宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)，在腫瘤發(fā)生和放療抵抗過程中發(fā)揮重要作用〔5，6〕。研究指出，EBV-miR-BART6-3p可通過調(diào)控長鏈非編碼RNA(lncRNA)LOC553103/stathmin(STMN1)軸抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖〔7〕，而STMN1在有絲分裂紡錘體形成過程中發(fā)揮著重要作用，且在腫瘤中異常高表達(dá)，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和放療敏感性參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔8，9〕。本研究猜測EBV-miR-BART6-3p可能通過調(diào)控STMN1表達(dá)參與鼻咽癌細(xì)胞凋亡和放療抵抗，故開展體外細(xì)胞實驗加以驗證，旨在揭示鼻咽癌發(fā)生和放療抵抗的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測試劑盒(貨號：BL705A，南通艾得爾)；青霉素鏈霉素雙抗(貨號：15140-122，美國Gibco)；脂質(zhì)體2000和Trizol試劑(貨號：11668、15596018，美國Invitrogen)；兔抗人STMN1和β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(貨號：ab52630、ab179467，美國Abcam)；miR-BART6-3p模擬物(貨號：M-01-S，上海吉瑪)；pcDNA3.4-STMN1過表達(dá)載體質(zhì)粒(貨號：KL-ZL3152，上?？吕咨?；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、全蛋白提取試劑盒和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號：90113、T8150、BC3710、CA1020，北京索萊寶)；生物顯微鏡(型號：E100，尼康)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號：371型，美國Thermo)；流式細(xì)胞儀(型號：FACSCalibur，美國BD)；凝膠成像分析系統(tǒng)、實時熒光定量PCR儀(型號：Gel Doc XR+、CFX96 Touch，美國Bio-Rad)；直線加速器(型號：NMSR600，東軟醫(yī)療)。

1.2HNE2細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將購自美國ATCC的人鼻咽癌HNE2細(xì)胞接種至DMEM培養(yǎng)基(含1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清)中，于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。將對數(shù)生長期的HNE2細(xì)胞接種至6孔板上后，培養(yǎng)至70%融合度時，細(xì)胞分為對照組(未處理)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、miR-BART6-3p組(轉(zhuǎn)染miR-BART6-3p模擬物)、miR-BART6-3p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-BART6-3p模擬物和pcDNA3.4空載體質(zhì)粒)和miR-BART6-3p+STMN1組(共轉(zhuǎn)染miR-BART6-3p模擬物和pcDNA3.4-STMN1過表達(dá)質(zhì)粒)，每組設(shè)3個復(fù)孔。按照脂質(zhì)體2000說明書對HNE2細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染，48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3實時熒光定量PCR檢測HNE2細(xì)胞中miR-BART6-3p和STMN1 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取HNE2細(xì)胞總RNA后行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。以U6或β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HNE2細(xì)胞中miR-BART6-3p和STMN1 mRNA表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。由上海英捷公司合成的引物序列如下：miR-BART6-3p上游引物5′-GGTCACGGGCA CTCCTTGGATAGGTACC-3′，下游引物5′CCCAGTGAGCTCCACCATCAAA-3′；U6上游引物5′-CTCGC TTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′；STMN1上游引物5′-CCTCTGTTTGGCGCTTTTGTGCG-3′，下游引物5′-GGCACGCTTCTCCAGTTCTTTCACC-3′；β-actin上游引物5′-CACCATGAAGATCAAGATCATTGC-3′，下游引5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGC-3′。

1.4流式細(xì)胞儀檢測HNE2細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化收集待檢測的HNE2細(xì)胞后，使用磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞2次。以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，先后加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min后，采用流式細(xì)胞儀在60 min內(nèi)檢測HNE2細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.5克隆形成實驗檢測HNE2細(xì)胞放射敏感性 胰蛋白酶消化收集待檢測的HNE2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后根據(jù)X射線照射劑量接種至6孔細(xì)胞板上；培養(yǎng)達(dá)80%融合度時，分別以0、2、4、6、8 Gy劑量的X射線照射，且每個照射處理設(shè)置3個復(fù)孔；照射結(jié)束后，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 w左右；待有肉眼可見菌落出現(xiàn)時，終止培養(yǎng)；磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞后，以4%多聚甲醛固定15 min；經(jīng)吉姆薩染色20 min后，采用顯微鏡觀察HNE2細(xì)胞克隆數(shù)，計算HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)；采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線。實驗重復(fù)3次。

1.6Western印跡檢測HNE2細(xì)胞中STMN1蛋白表達(dá)水平 提取HNE2細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法定量蛋白濃度；將變性后的蛋白樣品行電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上；經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，加入1∶1 000稀釋的一抗室溫孵育過夜；再以1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光劑于暗室內(nèi)顯影曝光；β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析HNE2細(xì)胞中STMN1蛋白表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組HNE2細(xì)胞中miR-BART6-3p表達(dá)水平比較 miR-NC組HNE2細(xì)胞中miR-BART6-3p表達(dá)水平與對照組(1.02±0.11 vs 0.98±0.07)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.531，P=0.623)；而miR-BART6-3p組HNE2細(xì)胞中miR-BART6-3p表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(24.58±3.26 vs 1.02±0.11，t=12.510，P=0.000)。

2.2miR-BART6-3p對HNE2細(xì)胞凋亡的影響 miR-NC組HNE2細(xì)胞凋亡率與對照組(7.96±1.03 vs 8.62±1.25)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.706，P=0.519)；而miR-BART6-3p組HNE2細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-NC組(20.25±3.10 vs 7.96±1.03，t=6.516，P=0.003)。見圖1。

2.3miR-BART6-3p對HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響 對照組、miR-NC組和miR-BART6-3p組HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均呈X射線照射劑量依賴性降低(P<0.05)；相同劑量X射線照射后miR-NC組中HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與對照組無明顯改變(P>0.05)；而2、4、6、8 Gy miR-BART6-3p組HNE2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)顯著低于miR-NC組(P<0.05)，且增敏比SER為1.56。見表1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測HNE2細(xì)胞凋亡

表1 各組HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比較

2.4miR-BART6-3p對HNE2細(xì)胞中STMN1表達(dá)的影響 miR-NC組HNE2細(xì)胞中STMN1 mRNA和蛋白表達(dá)水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而miR-BART6-3p組中STMN1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖2和表2。

1～3：對照組、miR-NC組、miR-BART6-3p組圖2 Western印跡檢測STMN1蛋白表達(dá)

表2 各組細(xì)胞中STMN1 mRNA和蛋白表達(dá) 水平比較

2.5STMN1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-BART6-3p對HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)及凋亡率的影響 miR-BART6-3p組細(xì)胞凋亡率〔(20.83±2.32)%〕顯著高于miR-NC組〔(7.16±1.05)%,P<0.05〕，且放射增敏比SER為1.48；miR-BART6-3p+STMN1組HNE2細(xì)胞中STMN1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于miR-BART6-3p+pcDNA組，細(xì)胞凋亡率顯著低于miR-BART6-3p+pcDNA組(P<0.05)。miR-BART6-3p+pcDNA 組和miR-BART6-3p+STMN1組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均呈X 射線照射劑量依賴性降低(P<0.05)；而miR-BART6-3p+pcDNA 組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于 miR-BART6-3p+STMN1組(P<0.05)。且放射增敏比SER為0.75。見圖3、圖4和表3，表4。

1，2：miR-BART6-3p+pcDNA組，miR-BART6-3p+STMN1組圖3 Western印跡檢測STMN1蛋白表達(dá)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

表3 STMN1過表達(dá)后HNE2細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比較

表4 STMN1過表達(dá)后HNE2細(xì)胞凋亡率比較

3 討 論

EBV BART miRNA(EBV-miR-BART)在鼻咽癌EBV編碼的miRNA中表達(dá)量最高〔10〕，與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔11～13〕。李劍飛等〔14〕指出，鼻咽癌中異常高表達(dá)的EBV-miR-BART4和EBV-miR-BART8-3p可作為鼻咽癌診斷防治的潛在標(biāo)志物。Lin等〔15〕研究指出，EBV-miR-BART8-3p在鼻咽癌中呈高表達(dá)，可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和Erk1/2通路靶向RNF38誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。Wu等〔16〕報道指出，EBV-miR-BART4在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平的改變與患者臨床分期、淋巴結(jié)腫大程度和分化程度有關(guān)，而下調(diào)miR-BART4表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增強細(xì)胞的放射敏感性。

miR-BART6-3p是EBV-miR-BART中的一員，可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移在鼻咽癌中發(fā)揮著抑癌作用〔17〕，本研究結(jié)果表明，miR-BART6-3p過表達(dá)可誘導(dǎo)鼻咽癌HNE2細(xì)胞凋亡并增強其放射敏感性。STMN1是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的微管解聚蛋白，可通過調(diào)控微管動力，在細(xì)胞分裂、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用〔18〕。Hsu等〔19〕研究指出，STMN1在鼻咽癌中呈高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。汪文利等〔20〕研究指出，沉默STMN1表達(dá)可通過抑制SHH信號通路活化促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，增強腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。Sun等〔9〕研究指出，下調(diào)STMN1表達(dá)可增強鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。可見，STMN1與鼻咽癌發(fā)病及放療抵抗密切相關(guān)。Wang等〔7〕研究指出，miR-BART6-3p在鼻咽癌中可通過靶向吸附LOC553103間接調(diào)控STMN1表達(dá)；猜測miR-BART6-3p可能通過調(diào)控STMN1參與鼻咽癌細(xì)胞凋亡和放療抵抗過程。本研究結(jié)果提示在鼻咽癌中miR-BART6-3p促凋亡及放射增敏作用可能與其調(diào)控STMN1表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，miR-BART6-3p可通過下調(diào)STMN1表達(dá)促進(jìn)HNE2細(xì)胞凋亡并增強細(xì)胞放射敏感性。

綜上，miR-BART6-3p與鼻咽癌發(fā)病及放療抵抗密切相關(guān)，其可通過下調(diào)STMN1表達(dá)誘導(dǎo)鼻咽癌HNE2細(xì)胞凋亡并增強細(xì)胞的放射敏感性。