張麗 覃雪 何高見 羅愛華 高霞

(1達(dá)州市中心醫(yī)院老年病科，四川 達(dá)州 635000；2達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；3達(dá)州市中心醫(yī)院心身醫(yī)學(xué)科)

阿爾茨海默病是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病較為隱匿，主要表現(xiàn)為獲得性知識障礙、記憶力減退，常常伴隨有工作、生活等正常行為障礙〔1〕。阿爾茨海默病是僅次于心腦血管疾病、腦卒中、癌癥之后的影響老年人生活質(zhì)量的常見疾病，阿爾茨海默病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的熱點(diǎn)問題〔2〕。阿爾茨海默病的病理學(xué)特征為神經(jīng)元丟失、大腦皮質(zhì)萎縮及β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑等，目前阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制還沒有完全闡明，其中Aβ神經(jīng)毒性研究較為透徹〔3〕。Aβ沉積產(chǎn)生的老年斑是阿爾茨海默病發(fā)生的重要原因。Aβ25～35是阿爾茨海默病發(fā)生的關(guān)鍵毒性物質(zhì)，其可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔4〕。研究顯示，阿爾茨海默病還與miRNA的異常表達(dá)有關(guān)，miRNA參與影響神經(jīng)細(xì)胞損傷過程〔5〕。miR-34a是一個(gè)在人體內(nèi)廣泛表達(dá)的小分子RNA，參與細(xì)胞生長、凋亡等過程〔6〕。以前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在阿爾茨海默病中表達(dá)上調(diào)，并且抑制miR-34a可以提高caspase-3活化水平，miR-34a在阿爾茨海默病中可能發(fā)揮促進(jìn)作用〔7，8〕。本研究以PC12細(xì)胞為研究對象，用Aβ25～35處理構(gòu)建PC12細(xì)胞阿爾茨海默病體外模型，探討miR-34a在阿爾茨海默病神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細(xì)胞購自通派(上海)生物科技有限公司；p-蛋白激酶B(AKT)抗體購自美國Santacruze；Aβ25～35購自美國Sigma；inhibitor control、miR-34a inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；活性氧(ROS)水平檢測試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司；AKT抗體購自美國Proteintech；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；超氧化物歧化酶(SOD)水平檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；引物由廣州伯信生物科技有限公司合成；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平檢測試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 PC12細(xì)胞分為空白對照組(Control)組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組細(xì)胞分別在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)用含有Aβ25～35濃度為20 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組細(xì)胞分別為轉(zhuǎn)染inhibitor control、miR-34a inhibitor的PC12細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟完全按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明進(jìn)行。

1.3實(shí)熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測miR-34a表達(dá) Control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞，在細(xì)胞中添加Trizol試劑，提取細(xì)胞中的總RNA，配制去除基因組DNA反應(yīng)體系，包括：2 μl的5×gDNA Eraser緩沖液、200 μg總RNA、1 μl的gDNA Eraser，添加RNase free H2O至10 μl。在上述體系中添加1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix I、3 μl的miRNA RT Primer、4 μl的5×PrimeScript緩沖液，添加RNase free H2O至20 μl，放在37℃孵育15 min，放在85℃孵育5 s，合成cDNA。配制PCR體系，包括：1 μl的cDNA模板、10 μl的SYBR Primer Ex Taq、0.4 μl的上游和下游引物，添加ddH2O至20 μl，PCR程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)反應(yīng)得到的Ct值，按照2-△△Ct法計(jì)算miR-34a表達(dá)水平，內(nèi)參為U6。引物序列為：U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-34a上游：5′-GGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTA-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.4四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖 PC12細(xì)胞按照Control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組分組方法接種到96孔板內(nèi)，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，在每個(gè)孔中添加10 μl的MTT溶液，放在37℃孵育4 h。然后將孔內(nèi)的上清溶液棄掉，添加150 μl的二甲基亞砜溶液，震蕩反應(yīng)10 min。酶標(biāo)儀上測定每個(gè)孔450 nm OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 Control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷以后的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)懸浮洗滌2次以后，在細(xì)胞中添加200 μl的Binding緩沖液充分混合，再吸取5 μl碘化丙啶(PI)及膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)溶液添加到細(xì)胞中，放在室溫條件下結(jié)合孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測之前再添加300 μl的Binding緩沖液。

1.6Western印跡檢測細(xì)胞中C-caspase-3、p-AKT、AKT蛋白表達(dá) Control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞，添加RIPA蛋白裂解試劑，放在冰上裂解20 min，4℃，12 000 r/min離心10 min。收集上清溶液，用二喹啉甲酸(BCA)法測定提取蛋白濃度，放在-80℃保存?zhèn)溆?。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。在蛋白上樣孔內(nèi)添加30 μg的蛋白樣品，蛋白樣品在上樣之前需要與等體積的電泳緩沖液混合煮沸5 min。設(shè)置電泳電壓為100 V，電泳30 min以后，將電壓設(shè)置為120 V，繼續(xù)電泳2.5 h。取出凝膠，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5 min。將聚偏氟乙烯(PDVF)膜也浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。以400 mA的電流轉(zhuǎn)膜50 min。取出NC膜，放在含有5%牛血清白蛋白的封閉液中孵育結(jié)合2 h，然后將NC膜放在含有1∶200稀釋的C-caspase-3抗體、1∶600稀釋的p-AKT抗體、1∶800稀釋的AKT抗體中，放在4℃條件下孵育過夜。將PDVF膜置于1∶2 000稀釋的二抗溶液中，在室溫中孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)方法發(fā)光，分析條帶的灰度值。內(nèi)參為GAPDH，分析目的條帶的表達(dá)變化。

1.7ROS、SOD、GSH-Px水平檢測 Control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+Anti-NC組、Aβ25～35+Anti-miR-34a組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞，分別用ROS、SOD、GSH-Px水平檢測試劑盒檢測ROS、SOD、GSH-Px水平，步驟完全按照試劑盒說明進(jìn)行。ROS水平檢測結(jié)果以Control組作為內(nèi)參，分析相對熒光強(qiáng)度。

1.8AKT信號抑制劑對下調(diào)miR-34a的PC12細(xì)胞增殖、凋亡和ROS、SOD、GSH-Px水平影響 取轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后的PC12細(xì)胞，用含有Aβ25～35濃度為20 μmol/L和LY294002濃度為50 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，計(jì)為Aβ25～35+Anti-miR-34a+LY294002組，以Aβ25～35+Anti-miR-34a組作為對照，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Western印跡檢測細(xì)胞中C-caspase-3、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)，試劑盒檢測ROS、SOD、GSH-Px水平，步驟同上。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-34a inhibitor對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中miR-34a表達(dá)的影響 與Control組(1.00±0.08)比較，Aβ25～35處理以后的PC12細(xì)胞中的miR-34a表達(dá)水平(1.90±0.12)明顯升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后的PC12細(xì)胞經(jīng)過Aβ25～35處理以后，細(xì)胞中的miR-34a表達(dá)水平(0.75±0.06)較Aβ25～35+Anti-NC組(1.89±0.16)明顯下降(P<0.05)。提示miR-34a inhibitor下調(diào)Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平。

2.2miR-34a inhibitor對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞增殖和凋亡影響 Aβ25～35處理以后的PC12細(xì)胞增殖能力明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞中C-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后的PC12細(xì)胞經(jīng)過Aβ25～35處理以后，細(xì)胞增殖能力明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，細(xì)胞中C-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。提示miR-34a inhibitor提高Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞增殖能力并減少細(xì)胞凋亡。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

1～4：Control組，Aβ25～35組，Aβ25～35+Anti-NC組，Aβ25～35+Anti-miR-34a組；圖3同圖2 Western印跡檢測C-caspase-3蛋白表達(dá)

表1 各組PC12細(xì)胞OD值、凋亡率和 C-caspase-3蛋白水平比較

2.3miR-34a inhibitor對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中ROS、SOD、GSH-Px水平影響 Aβ25～35處理以后的PC12細(xì)胞中ROS水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后的PC12細(xì)胞經(jīng)過Aβ25～35處理以后，細(xì)胞中ROS水平明顯降低，SOD、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)。見表2。提示miR-34a inhibitor提高Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性，減少細(xì)胞中ROS積累。

表2 各組PC12細(xì)胞中ROS、SOD、 GSH-Px水平比較

2.4miR-34a inhibitor對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中AKT信號影響 Aβ25～35處理以后的PC12細(xì)胞p-AKT蛋白水平明顯下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后的PC12細(xì)胞經(jīng)過Aβ25～35處理以后，細(xì)胞中p-AKT蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖3、表3。提示miR-34a inhibitor提高Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中AKT信號激活水平。

圖3 Western印跡檢測各組PC12細(xì)胞 p-AKT、AKT蛋白水平

表3 各組PC12細(xì)胞中p-AKT、 AKT蛋白水平比較

2.5AKT信號抑制劑對miR-34a inhibitor激活A(yù)β25～35條件下PC12細(xì)胞中AKT信號的影響 AKT信號抑制劑處理后的轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中p-AKT蛋白水平明顯下降(P<0.05)。見圖4、表4。提示AKT信號抑制劑減弱miR-34a inhibitor對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞中AKT信號激活作用。

2.6AKT信號抑制劑對miR-34a inhibitor影響Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞增殖、凋亡和ROS、SOD、GSH-Px水平的作用 AKT信號抑制劑處理后的轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞OD值明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞中C-caspase-3蛋白水平明顯升高，細(xì)胞中ROS水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯下降(P<0.05)。見圖5、表5、圖6。提示AKT信號抑制劑逆轉(zhuǎn)miR-34a inhibitor對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞增殖、凋亡和ROS、SOD、GSH-Px影響。

1～2:Aβ25～35+Anti-miR-34a組,Aβ25～35+Anti-miR-34a+LY294002組；圖6同圖4 Western印跡檢測兩組PC12細(xì)胞 p-AKT、AKT蛋白水平

表4 兩組PC12細(xì)胞中p-AKT、 AKT蛋白水平比較

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組細(xì)胞凋亡

表5 兩組PC12細(xì)胞OD值、凋亡率、C-caspase-3蛋白水平和ROS、SOD、GSH-Px水平比較

圖6 Western印跡檢測兩組C-caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

Aβ是常用的體外研究阿爾茨海默病細(xì)胞模型誘導(dǎo)因子〔9〕。氧化損傷可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。研究顯示，機(jī)體內(nèi)的SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性下降以后，細(xì)胞內(nèi)的ROS不能被及時(shí)清除而聚集在細(xì)胞內(nèi)，過量的ROS能夠激活細(xì)胞內(nèi)的caspase凋亡反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔10〕。caspase-3是caspase凋亡反應(yīng)的下游因子，也是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其活化后形成C-caspase-3能夠不可逆的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔11〕。本研究結(jié)果提示Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和氧化損傷，說明構(gòu)建了PC12細(xì)胞阿爾茨海默病體外模型。

miRNA是一種非編碼的RNA，其長度一般在20 nt左右，在自然界真核生物體內(nèi)廣泛存在〔12〕。miRNA功能多樣，其參與不同類型細(xì)胞生長、凋亡、能量代謝、氧化應(yīng)激等生理過程，miRNA是一個(gè)重要調(diào)控因子〔13〕。有研究報(bào)道顯示，miRNA還與多種人類疾病的發(fā)生有關(guān)，miRNA可能是疾病治療的分子標(biāo)志物〔14〕。最近的研究顯示，miRNA參與阿爾茨海默病的發(fā)生，其與神經(jīng)損傷有關(guān)〔15〕。以前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在阿爾茨海默病中表達(dá)上調(diào)，并且下調(diào)miR-34a可降低caspase-3活化水平〔6,7〕。本研究結(jié)果說明下調(diào)miR-34a可以改善PC12細(xì)胞阿爾茨海默病體外模型損傷，這與上述研究結(jié)果相符合，均證實(shí)下調(diào)miR-34a可能具有改善阿爾茨海默病的作用。

AKT信號通路在人體內(nèi)的多個(gè)生理以及病理過程中均發(fā)揮重要作用，其可以影響細(xì)胞的生長、代謝、凋亡、衰老等過程，AKT磷酸化水平升高后標(biāo)志著AKT信號通路被激活〔16～19〕。研究顯示，AKT在阿爾茨海默病中激活水平下降，并且抑制AKT信號通路促進(jìn)Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞凋亡和損傷〔20～22〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，AKT信號通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-34a對Aβ25～35條件下PC12細(xì)胞增殖、凋亡和氧化損傷的作用，提示下調(diào)miR-34a通過激活A(yù)KT信號改善PC12細(xì)胞阿爾茨海默病體外模型損傷。

綜上，miR-34a在阿爾茨海默病中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)其表達(dá)可以減少PC12細(xì)胞阿爾茨海默病體外模型細(xì)胞凋亡，改善氧化損傷，作用機(jī)制與激活A(yù)KT信號有關(guān)。以后實(shí)驗(yàn)中應(yīng)探討miR-34a通過何種靶向調(diào)控機(jī)制影響AKT信號通路及細(xì)胞凋亡和氧化損傷。