李樹(shù)霖 牛晨凱 李馮銳

(包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

帕金森病(PD)是中老年常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病人數(shù)增多，患者生活質(zhì)量下降甚至縮短預(yù)期壽命。流行病學(xué)及病例-對(duì)照研究顯示，環(huán)境毒素對(duì)腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有毒性作用，長(zhǎng)期接觸可引發(fā)PD〔1〕。分泌粒蛋白(SCG)3屬于分泌粒家族，廣泛且特異地分布于神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及內(nèi)分泌細(xì)胞，是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌顆粒及內(nèi)分泌腺體功能重要的生物學(xué)標(biāo)記之一〔2〕。SCG3對(duì)神經(jīng)與精神疾病、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及其他代謝性疾病的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床指導(dǎo)意義〔3，5〕。本研究采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)或1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)小鼠及細(xì)胞模擬PD模型，檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中SCG3的表達(dá)分布及變化情況，探討SCG3參與神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)及其參與PD發(fā)病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自Gibco公司。MPTP及MPP+均購(gòu)自Sigma公司。酪氨酸羥化酶(TH)抗體(ab112)、SCG3抗體(ab65821)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(ab7260)、離子鈣接頭蛋白(Iba1)抗體(ab153696)、β-肌動(dòng)蛋白(Actin)抗體(ab8227)均購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor488熒光標(biāo)記山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗兔IgG均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y及星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118均購(gòu)自中科院細(xì)胞中心(源自美國(guó)ATCC)。在37℃、5% CO2及濕化條件下，用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，用含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)U118細(xì)胞。根據(jù)生長(zhǎng)狀況，每1～2 d更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90% 時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)并分為控制組和實(shí)驗(yàn)組。

1.3細(xì)胞免疫熒光 將細(xì)胞接種于含有蓋玻片的35 mm 培養(yǎng)皿中，每皿約5×105個(gè)細(xì)胞；24 h后，將控制組更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含3 mmol/L MPP+的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)束培養(yǎng)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)/CM〔含1 mmol/L氯化鎂(MgCl2)及0.1 mmol/L氯化鈣(CaCl2)的PBS〕洗滌3次，加入1 ml 3% 的多聚甲醛，室溫固定15 min；加入0.2% Triton X-100，室溫作用10 min；加入含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS/CM室溫封閉30 min；加入SCG3特異性抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；加入熒光標(biāo)記抗體(1∶500稀釋)，室溫避光孵育1 h。每次孵育后均用PBS/CM洗滌3次，每次10 min?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集結(jié)果。

1.4動(dòng)物飼養(yǎng)與造模 實(shí)驗(yàn)選用雄性、8周齡、體重22～24 g的C57BL6小鼠30只(購(gòu)自包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，分為對(duì)照組與模型組。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，模型組腹腔注射MPTP(30 mg/kg體重)，每天1次，連續(xù)給藥7 d。給藥結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)21 d，期間通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠自發(fā)行動(dòng)能力進(jìn)行檢測(cè)。曠場(chǎng)系統(tǒng)為長(zhǎng)寬均為50 cm、高40 cm的方形箱子，正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用小鼠調(diào)試好系統(tǒng)，將底板擦拭干凈，小鼠背對(duì)實(shí)驗(yàn)者輕放入曠場(chǎng)中央，蓋上遮光布，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持弱光照明。記錄小鼠運(yùn)動(dòng)總距離以反應(yīng)小鼠的自發(fā)行動(dòng)能力，5 min后停止攝像。每只小鼠檢測(cè)結(jié)束后將底板清洗干凈并用酒精擦拭以避免氣味對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

1.5樣品采集與檢測(cè) 小鼠取腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h。固定后，制作石蠟切片。免疫組織化學(xué)檢測(cè)腦組織中多巴胺能神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布與表達(dá)(選用細(xì)胞標(biāo)記物抗體，標(biāo)記多巴胺能神經(jīng)元采用TH抗體1∶1 500稀釋，標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞采用Iba1抗體1∶1 000稀釋，標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞采用GFAP抗體1∶1 000稀釋)，SCG3蛋白的分布與表達(dá)(SCG3抗體1∶1 000稀釋)，組織免疫熒光檢測(cè)腦組織SCG3蛋白的分布與表達(dá)(SCG3抗體1∶1 000稀釋)，相差或熒光顯微鏡下觀察并采集結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1小鼠PD模型建立與檢測(cè) 與對(duì)照組比較，模型組在規(guī)定時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離明顯減少〔n=6，(5 132.63±1 353.62)cm vs (3 830.95±519.14)cm,P<0.05〕,黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元密度降低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量〔n=6，(115.33±10.09)個(gè)vs(99.83±8.06)個(gè)〕顯著減少(P<0.05)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多(n=6，Iba1：1.93±0.70 vs 2.95±0.55；GFAP：1.76±0.47 vs 2.66±0.51;均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2小鼠腦及黑質(zhì)紋狀體SCG3表達(dá)與分布 對(duì)照組小鼠部分多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)SCG3，模型組小鼠大部分多巴胺能神經(jīng)元中未檢測(cè)到SCG3的表達(dá)，而疑似星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到大量SCG3的表達(dá)；模型組SCG3陽(yáng)性囊泡數(shù)量明顯增多(1.23±0.24 vs 2.49±0.43,P<0.05，n=6)，聚集在細(xì)胞核周圍(圖2)。

2.3細(xì)胞系中SCG3表達(dá)與分布 在SH-SY5Y 細(xì)胞中SCG3表達(dá)豐富，廣泛分布于整個(gè)胞質(zhì)及神經(jīng)突中，MPP+誘導(dǎo)后，SCG3蛋白表達(dá)量顯著下降(控制組：2.51±0.30 vs 實(shí)驗(yàn)組：1.32±0.40,n=6,P<0.05)；在U118 細(xì)胞中SCG3主要分布于細(xì)胞核周圍，MPP+誘導(dǎo)后，SCG3蛋白表達(dá)量顯著增高(控制組：2.04±0.32 vs 實(shí)驗(yàn)組：3.80±0.71，n=6,P<0.05)，細(xì)胞核周圍增多尤為顯著(圖3)。

圖2 MPTP對(duì)小鼠腦組織SCG3蛋白的影響(全腦×4，黑質(zhì)紋狀體×40)

圖3 免疫熒光檢測(cè)MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞、 U118細(xì)胞 SCG3表達(dá)與分布的影響(×40)

3 討 論

PD病因尚不清楚，目前研究認(rèn)為與年齡老化、遺傳易感性及接觸神經(jīng)毒素等綜合因素有關(guān)〔6,7〕。PD主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部(SNpc)多巴胺能神經(jīng)元大量凋亡，殘留的神經(jīng)元胞質(zhì)中嗜酸性Lewy包涵小體形成，損傷神經(jīng)元周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化。大量神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致多巴胺合成減少，黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺能與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)平衡失調(diào)，膽堿能遞質(zhì)活性相對(duì)增高，表現(xiàn)出錐體外系功能亢進(jìn)的臨床表現(xiàn)?；罨纳窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的功能蛋白、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子改變并釋放大量炎性因子，導(dǎo)致細(xì)胞外微環(huán)境紊亂，進(jìn)一步加劇神經(jīng)元損傷及神經(jīng)遞質(zhì)失衡。神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞)的相互通信在PD病變啟動(dòng)及疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用〔8,9〕。MPTP及活性形式MPP+是目前被公認(rèn)的神經(jīng)毒素，被廣泛應(yīng)用于PD發(fā)病機(jī)制及治療等細(xì)胞學(xué)與動(dòng)物學(xué)的基礎(chǔ)研究〔10〕。

分泌顆粒廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞，是儲(chǔ)存生物活性肽類及胺類的重要細(xì)胞器。在分泌顆粒形成過(guò)程中，SCG3可作為特異性受體引導(dǎo)分泌粒家族成員CgA、CgB、CgC等與生物活性物質(zhì)有效聚集，之后通過(guò)膽固醇依賴方式結(jié)合在膜的類脂質(zhì)成分上，促進(jìn)分泌顆粒形成并將生物活性物質(zhì)包裝于囊泡〔11,12〕。SCG3對(duì)生物活性物質(zhì)的聚集、靶向輸送、分泌顆粒的形成及后續(xù)的囊泡內(nèi)包裝均發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果推測(cè)SCG3可能通過(guò)影響多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中生物活性肽類與胺類的運(yùn)輸、包裝及分泌顆粒形成從而參與PD發(fā)病。

對(duì)細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下SH-SY5Y細(xì)胞富含SCG3蛋白，經(jīng)MPP+誘導(dǎo)后，SCG3蛋白表達(dá)下降，SCG3在多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)包括多巴胺在內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸與代謝的生物學(xué)功能〔13,14〕，神經(jīng)毒素影響上述功能，是誘使機(jī)體出現(xiàn)PD癥狀的原因之一。在U118 細(xì)胞中，經(jīng)MPP+誘導(dǎo)后SCG3蛋白表達(dá)顯著上升，SCG3陽(yáng)性囊泡數(shù)量明顯增多，聚集在核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，推測(cè)其功能為包裝與運(yùn)輸活化膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的功能蛋白、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、炎性因子等〔5,15,16〕。神經(jīng)炎癥反應(yīng)是PD發(fā)病的機(jī)制之一，活化星形膠質(zhì)細(xì)胞可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理標(biāo)記〔17〕，活化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)自分泌、旁分泌的方式影響多巴胺能神經(jīng)元的活性及凋亡，啟動(dòng)PD發(fā)病并加速其病程〔18〕。

綜上，生理狀態(tài)下SCG3分布于多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，毒素誘導(dǎo)后多巴胺能神經(jīng)元中SCG3下降，星形膠質(zhì)細(xì)胞中SCG3明顯增多。SCG3可能通過(guò)運(yùn)輸、包裝神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)參與PD發(fā)病。上述研究結(jié)果填補(bǔ)了PD發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并對(duì)SCG3的生物學(xué)功能作出重要補(bǔ)充。