文曉東 譚文瀾 梁明坤 劉鈺 王春玲

(1廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2廣西中醫(yī)藥大學)

帕金森病(PD)是常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失和神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)路易小體形成為特征性病理改變。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導的細胞凋亡及其通路相關(guān)基因的異常表達在PD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用〔1〕。當細胞遭遇外界刺激時，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78/鈣蛋白酶(calpain)/半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12信號通路是ERS介導的相關(guān)凋亡通路之一〔2，3〕。斂肝熄風止顫方源自《傷寒論·厥陰病》主方烏梅丸，是臨床治療PD的經(jīng)驗方。研究表明，斂肝熄風止顫方可抑制黑質(zhì)神經(jīng)細胞的凋亡〔4〕，提示斂肝熄風止顫方對PD具有保護作用。鑒于ERS對PD的調(diào)控作用，本研究從調(diào)節(jié)ERS減少多巴胺能神經(jīng)元凋亡角度探討斂肝熄風止顫方對PD的保護作用機制，主要探討斂肝熄風止顫方是否能改善6-羥基多巴胺(OHDA)誘導的PD模型大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)細胞的凋亡情況，并觀察是否通過ERS 介導的GRP78/calpain/Caspase-12信號通路對多巴胺能神經(jīng)元起到保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年SD大鼠100只，雌雄各半，體重210～240 g，購自廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(桂) 2016-0012。所有大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學SPF動物房。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h晝夜交替，室溫(25±2)℃，相對濕度(50±2)%。自由進食、飲水。

1.2藥物 斂肝熄風止顫方組成如下：烏梅20 g、黃連3 g、白芍20 g、當歸10 g、 熟附子10 g、熟地黃10 g、何首烏20 g、川芎10 g、葛根20 g、人參10 g、石菖蒲5 g、天麻10 g、龜板10 g、炙甘草3 g。中藥飲片購自廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院藥劑科并由其提供正品鑒定。相當于藥材量10倍的蒸餾水浸泡30 min，開始時用水量高過藥面2～5 cm。煮沸后，文火30 min，用紗布過濾，倒出藥汁，再將藥材量8倍水倒入藥材中，煮沸后，文火30 min，將兩次的藥汁合并，濃縮至1.06 g/ml。大鼠灌胃藥液的劑量按照人/鼠公斤體重的等效劑量計算。

1.3試劑與儀器 6-OHDA、阿撲嗎啡(APO)試劑盒均購自美國Sigma公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司；GRP78一抗抗體、calpain一抗抗體、Caspase-12一抗抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。低溫臺式離心機(Eppendorf公司，美國)，酶標自動分析儀(BioTek公司，美國)，電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR擴增儀(Bio-rad公司，美國)，脫色搖床、電子分析天平、超薄切片機(Leica公司，德國)，H-7500型透射電子顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，TL-251603型大鼠腦立體定位儀(Stoelting公司，美國)。

1.4實驗分組與模型制備 分組：將100只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組15只，造模組85只，造模組接受PD模型制備，將成模的60只大鼠按體重結(jié)合旋轉(zhuǎn)圈數(shù)隨機分為模型組、斂肝熄風止顫方低劑量組(0.36 g/kg)、中劑量組(0.72 g/kg)及高劑量組(1.44 g/kg)(簡稱低劑量組、中劑量組、高劑量組)各15只。模型制備：采用6-OHDA 腦左側(cè)紋狀體立體定向注射制備PD大鼠模型，參考文獻〔4〕，以10%水合氯醛(35 ml/kg)給予大鼠腹腔注射麻醉。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜〔5〕，準確定位左側(cè)紋狀體坐標，于左側(cè)紋狀體部位注射溶解有抗壞血酸的6-OHDA(5 μg/μl)，術(shù)后予青霉素肌肉注射預(yù)防感染。假手術(shù)組注射等體積的0.02%抗壞血酸生理鹽水。術(shù)后第2周開始將造模大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)進行旋轉(zhuǎn)行為測試。觀察30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，若大鼠恒定右轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速>7圈/min或30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>210圈表明PD造模成功。

1.5給藥方法 根據(jù)人/鼠公斤體重的等效劑量計算方法，本研究斂肝熄風止顫方生藥量為7.5 g/kg，去藥渣合并藥液后對藥汁進行濃縮，最終藥液濃度為1.06 g/ml。隨后對中藥組給予低、中、高劑量斂肝熄風止顫湯，分別相當于按人和動物體表面積比率換算的臨床等效劑量的1/2、1、2倍，各給藥組灌胃給藥，假手術(shù)組及模型組接受等容積生理鹽水灌胃。1次/d，給藥4 w。

1.6組織病理學蘇木素-伊紅(HE)染色 末次給藥后的次日，每組取5只大鼠，參考文獻〔4〕，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)深度麻醉后進行心臟灌流。取出完整腦組織，固定于4%多聚甲醛中24 h。然后梯度脫水，石蠟包埋，根據(jù)腦立體定位圖譜〔5〕，將蠟塊先快速厚切，確認切到黑質(zhì)部位后，調(diào)整片厚為4 μm。每只大鼠黑質(zhì)部位各取5張切片，用于組織病理學HE染色檢測。參考文獻〔6〕進行HE染色。

1.7RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測GRP78、calpain、Caspase-12 mRNA表達 每組取5只大鼠斷頭取腦，迅速分離出中腦黑質(zhì)組織，參考文獻〔7〕，按照 TRIZOL說明書提取總RNA。取1 μg的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80℃保存。按照PCR擴增試劑盒說明書，建立PCR體系。在實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。引物序列為GRP78：正義鏈：5′-TGCAGCAGGACATCAAGTTC-3′,反義鏈：5′-TACGCCTCAGCAGTCT CCTT-3′;calpain：正義鏈：5′-GGAAGAAGATGAA GATGATGAG-3′,反義鏈：5′-TTGCTGAGGTGGATGTTG-3′;Caspase-12：正義鏈：5′-TGCCAATTCCGACA AACAGC-3′,反義鏈：5′-TGGATTCTGATGCAGA AGATGGT-3′;β-actin：正義鏈：5′-GCTCCTCCTGAGCGCAAGT-3′反義鏈：TCATCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3′。以β-actin作為內(nèi)參對照，利用PCR試劑盒對各組大鼠腦黑質(zhì)中GRP78、calpain、Caspase-12 mRNA 的表達水平進行檢測，基因的相對表達量用 2-ΔΔCt法計算。

1.8Western印跡檢測GRP78、calpain、Caspase-12蛋白表達 每組取5只大鼠，取腦，快速分離中腦黑質(zhì)組織，參考文獻〔8〕將黑質(zhì)組織加裂解液冷凍勻漿，離心10 min，上清液利用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液水浴鍋中煮沸10 min后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，取出SDS-PAGE凝膠，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜完成后的 PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST中在室溫下封閉1 h。棄封閉液后加入一抗抗體〔GRP78(1∶1 000)、calpain(1∶500)、Caspase-12(1∶1 000)進行孵育，于搖床上4℃振搖過夜；次日棄去一抗，TBST洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的二抗中(均1∶2 000)室溫條件下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液中反應(yīng)1 min，應(yīng)用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件進行半定量分析。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1斂肝熄風止顫方對6-OHDA大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)學的影響 各組腦黑質(zhì)HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦黑質(zhì)細胞數(shù)目較多，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。模型組腦黑質(zhì)細胞數(shù)目較少，輪廓形態(tài)不清晰，部分神經(jīng)元發(fā)生固縮，膠質(zhì)細胞浸潤。與模型組比較，斂肝熄風止顫方中、高劑量組神經(jīng)細胞數(shù)目明顯增多，輪廓形態(tài)較之清晰，神經(jīng)膠質(zhì)細胞少量浸潤；而低劑量組腦黑質(zhì)可見部分神經(jīng)細胞發(fā)生固縮，中量神經(jīng)膠質(zhì)細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組腦黑質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)學(HE染色，×200 )

2.2各組腦黑質(zhì)GRP78、calpain、Caspase-12 蛋白濃度變化及mRNA表達 與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組腦黑質(zhì)GRP78、calpain、Caspase-12蛋白及mRNA表達顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量組腦黑質(zhì)GRP78、calpain、Caspase-12蛋白及mRNA表達和低劑量組calpain蛋白及mRNA表達均顯著下降(P<0.01，P<0.05)，而低劑量組腦黑質(zhì) GRP78、Caspase-12蛋白及mRNA表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表1。

1～5：低劑量組、中劑量組、高劑量組、假手術(shù)組、模型組圖2 各組腦黑質(zhì)GRP78、calpain、Caspase-12 蛋白表達

表1 各組腦黑質(zhì)GRP78、calpain、Caspase-12蛋白水平及mRNA表達比較

3 討 論

PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇。顫證根據(jù)傷寒六經(jīng)辨證，病在厥陰，以肝臟為首要臟腑。肝主疏泄，疏泄太過，肝風內(nèi)動，則發(fā)為震顫；肝主藏血，濡養(yǎng)筋脈，厥陰臟虛，筋失濡養(yǎng)，則筋脈拘急，發(fā)為肢體僵直少動。故顫證的這兩大主癥均符合厥陰病的主要病機〔9〕?？梢娯赎幣K虛、肝臟功能失調(diào)貫穿于顫證發(fā)病的全過程，是顫證病變過程中的重要病理生理學機制。因此，斂肝熄風，養(yǎng)血濡筋法是治療顫證的關(guān)鍵治則，并且要貫穿于顫證治療的始終〔10〕。斂肝熄風止顫方(原名：PD2號科研方)源自《傷寒論》厥陰病主方烏梅丸，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用，對早中期PD療效顯著，對晚期PD患者也有一定療效〔11～13〕。

有研究曾對斂肝熄風止顫方的神經(jīng)保護作用機制進行初步探討，發(fā)現(xiàn)斂肝熄風止顫方能改善PD模型大鼠行為學癥狀，增強抗氧化應(yīng)激能力，增加黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡〔14，15〕。此外還發(fā)現(xiàn)斂肝熄風止顫方可能通過調(diào)節(jié)B細胞淋巴瘤(Bcl)-2/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的比值，抑制黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡起到神經(jīng)保護作用〔16〕。本研究在上述試驗基礎(chǔ)上進一步探討斂肝熄風止顫方的神經(jīng)保護作用機制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種復(fù)雜的細胞器，主要負責膜蛋白、分泌蛋白的折疊和轉(zhuǎn)錄后處理。細胞在藥物毒性、環(huán)境毒物、缺氧、感染等應(yīng)激條件下，蛋白質(zhì)在ER內(nèi)轉(zhuǎn)運障礙，出現(xiàn)錯誤折疊及或未折疊蛋白在ER腔內(nèi)的聚集，稱為ERS〔17〕。早期ERS發(fā)生后機體啟動未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)以恢復(fù) ER 內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而持續(xù)或過強的ERS損傷了ER的功能時，能啟動凋亡通路誘導細胞凋亡〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用〔19，20〕，抑制 ERS 可減少多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，起到神經(jīng)保護作用，有望成為神經(jīng)退行性疾病包括PD的治療靶點〔21〕。ER特有的Caspase-12激活通路是ERS誘發(fā)的凋亡途徑之一，ERS狀態(tài)下，Caspase-12 被激活，進而激活下游Caspase-9、Caspase-3 級聯(lián)反應(yīng)，介導細胞凋亡〔22〕。Caspase-12 的激活啟動機制之一是主要通過calpain活化，在ERS時，ER鈣平衡打亂，細胞內(nèi)鈣離子水平升高引起calpain活化，剪切定位于ER膜上的Caspase-12 前體，Caspase-12 活化啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而導致細胞發(fā)生凋亡〔23〕。有研究表明ERS GRP78/calpain/Caspase-12 激活通路與 PD 有密切聯(lián)系〔24〕。因此，利用ERS作為PD治療的作用靶點，通過抑制ERS來減輕多巴胺能神經(jīng)元損傷。本文推測通過人為的方式調(diào)控ERS中的調(diào)節(jié)因子GRP78及其下游calpain-Caspase-12信號通路，可減少多巴胺能神經(jīng)元的死亡，為PD的臨床治療提供一個新的策略。本研究結(jié)果提示6-OHDA可引起ERS，激活 GRP78/calpain/Caspase-12通路，導致細胞凋亡發(fā)生。

綜上，斂肝熄風止顫方可能通過抑制PD模型大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)細胞ERS的損傷，減少GRP78的表達，抑制Caspase-12信號通路的活性，對PD發(fā)揮神經(jīng)保護作用，后期可對相關(guān)ERS通路進行更深入的探索。