鐘曉琴，寧振求,2，王 凱,2，鄧敏貞,2*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣州 510120）

阿爾茲海默病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)是學(xué)習(xí)障礙、記憶力下降等認(rèn)知能力損傷[1]。研究報(bào)道淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）水解后會(huì)誘發(fā)β 淀粉樣蛋白（Aβ）增加，其異常沉積會(huì)引起神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥等病理現(xiàn)象[2]。此外，神經(jīng)炎癥的加劇也會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展[3]。在阿爾茲海默病的神經(jīng)元中Aβ 會(huì)損害自噬小泡的運(yùn)輸過程，造成阿爾茲海默病相關(guān)的自噬病理現(xiàn)象[4]。定志小丸是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的經(jīng)典方劑，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其成分對(duì)血管性癡呆小鼠具有緩解海馬神經(jīng)元損傷的作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究定志小丸成分對(duì)阿爾茲海默病模型小鼠的作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 70 只APP/PS1 雄性小鼠（SPF 級(jí)，5月齡）和10 只C57BL/6 雄性小鼠（SPF 級(jí)，5 月齡）購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)是SYXK（粵）2018-0034。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，其倫理編號(hào)是2020001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在日照時(shí)長(zhǎng)12 h，自由飲水，溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%的SPF 級(jí)環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)3 d 后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人參皂苷Rb3 和β-細(xì)辛醚（批號(hào)：wkq18020701 和wkq18042602，純度≥98%，四川省維克奇生物技術(shù)有限公司）；多奈哌齊片（批號(hào)：1806077，每片10 mg，中國(guó)衛(wèi)材藥業(yè)有限公司）；Akt 抑制劑（LY294002，貨號(hào)：S1105，美國(guó)Selleck 公司）；自噬抑制劑（3-methyladenine，貨號(hào)：S2767，美國(guó)selleck 公司）；單胺氧化酶（MAO）、活性氧（ROS）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和Beclin-1 ELISA 試劑盒（批號(hào)均是01/2021，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；蘇木素伊紅染色試劑盒（貨號(hào)：C0105M，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。多功能染色機(jī)（ST5020，上海徠卡儀器有限公司）；基礎(chǔ)型分散機(jī)（IKA T10，德國(guó)IKA 公司）；高速冷凍離心機(jī)（5804R，德國(guó)Eppendorf 公司）；電子天平（ME403，上海梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司]；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Biotek-EON，美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥劑量 將轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為6組：模型組、人參皂苷Rb3 組（15 mg/kg，灌胃），β-細(xì)辛醚組（45 mg/kg，灌胃），聯(lián)合組（人參皂苷Rb3 15 mg/kg 加β-細(xì)辛醚45 mg/kg，灌胃），多奈哌齊組（3 mg/kg，灌胃）、Akt 抑制劑組（25mg/kg，腹腔注射給藥）和自噬抑制劑組（30 mg/kg，灌胃），并設(shè)正常組（C57BL/6 小鼠），每組10 只。除模型組和正常組給予等體積生理鹽水，各組給藥30 d，每天1 次。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 ELISA 檢測(cè)小鼠皮質(zhì)組織MAO、ROS、8-OHDG、TNF-α、IL-6、IL-10 和Beclin-1 的含量 各組小鼠給藥結(jié)束后，經(jīng)10%水合氯醛（350 mg/kg，灌胃）麻醉，用生理鹽水心臟灌注后，迅速在冰臺(tái)上開顱取腦，分離皮質(zhì)組織，保存在-80 ℃冰箱待用。把組織按1:9（重量g : 體積mL）比例加入生理鹽水，電動(dòng)勻漿后4 ℃ 10 000 r/min 離心10 min，取組織上清液，按試劑盒說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)指標(biāo)的吸光度。

1.3.2 HE 染色觀察小鼠皮質(zhì)組織形態(tài) 把各組小鼠皮質(zhì)組織用4%水合氯醛固定24 h，按常規(guī)脫水包埋操作，按4 μm 厚度切片，把各組玻片置自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE 染色處理，中性樹脂封片，置光學(xué)顯微鏡中觀察組織病理狀態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)因子MAO、ROS 和8-OHDG 的含量變化 從圖1 可知，與正常組比較，模型組的MAO、ROS 和8-OHDG 含 量增加（P＜0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量減少（P＜0.01），而Akt 抑制劑組的MAO、ROS 和8-OHDG 含量增加（P＜0.01）。與多奈哌齊組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和Akt 抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量增加（P＜0.01），而自噬抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量減少（P＜0.01）。與自噬抑制劑組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和Akt 抑制劑組的MAO、ROS、8-OHDG 含量增加（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠皮質(zhì)中MAO、ROS 和8-OHDG 的含量變化

2.2 各組小鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量變化 從圖2 可知，與正常組比較，模型組的TNF-α 和IL-6含量增加（P＜0.01），IL-10含量減少（P＜0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量減少（P＜0.01），IL-10 含量增加（P＜0.01），而Akt 抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量增加（P＜0.01），IL-10 含量減少（P＜0.01）。與多奈哌齊組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和Akt 抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量增加（P＜0.01），IL-10 含量減少（P＜0.01），而自噬抑制劑組的TNF-α 和IL-6 含量減少（P＜0.01），IL-10 的含量增加（P＜0.01）。與自噬抑制劑組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和Akt 抑制劑組的TNF-α 和IL-6 的含量增加（P＜0.01），IL-10 含量減少（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠皮質(zhì)中TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量變化

2.3 各組小鼠的自噬相關(guān)因子Beclin-1 的含量變化 從圖3 可知，與正常組比較，模型組的Beclin-1含量增加（P＜0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的Beclin-1 的含量減少（P＜0.01），而Akt 抑制劑組的Beclin-1 的含量增加（P＜0.01）。與多奈哌齊組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和Akt 抑制劑組的Beclin-1 含量增加（P＜0.01），而自噬抑制劑組的Beclin-1 含量減少（P＜0.01）。與自噬抑制劑組比較，人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和Akt 抑制劑組的Beclin-1 含量增加（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠皮質(zhì)中Beclin-1 的含量變化

2.4 各組小鼠的皮質(zhì)組織病理學(xué)情況 如圖4 所示，正常組的皮質(zhì)組織細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊，細(xì)胞致密，而模型組和Akt 抑制劑組的細(xì)胞間隙較大，細(xì)胞核數(shù)量較少、核固縮明顯，細(xì)胞排列較為稀疏和雜亂。人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組、多奈哌齊組和自噬抑制劑組的細(xì)胞間隙不太明顯，細(xì)胞核固縮有所緩解。

圖4 各組小鼠皮質(zhì)的組織病理學(xué)情況（×200，標(biāo)尺是100 μm）

3 討論

阿爾茲海默病是多因素誘發(fā)的復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、自噬障礙等是導(dǎo)致阿爾茲海默病產(chǎn)生與發(fā)展的重要因素[6]。研究發(fā)現(xiàn)自噬障礙會(huì)造成Aβ 的異常堆積，Aβ 還可通過產(chǎn)生活性氧和激活小膠質(zhì)細(xì)胞，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，加劇神經(jīng)元功能紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)元的發(fā)生病理?yè)p傷[7]。由于阿爾茲海默病病機(jī)多樣性且尚不明確，傳統(tǒng)用來(lái)治療阿爾茲海默病的藥物（多奈哌齊、美金剛等）雖可以減緩阿爾茲海默病病程,以對(duì)癥治療為原則，長(zhǎng)期服用會(huì)有明顯毒副作用[8-9]。中藥具有多靶點(diǎn)且不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)[10]，而阿爾茲海默病的臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)“呆癥”的范疇，可選用源于《備急千金要方》的益智方劑定志小丸，其具有化痰開竅、益智定志之功效[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)定志小丸中人參皂苷Rb3 聯(lián)合β-細(xì)辛醚對(duì)血管性癡呆模型小鼠具有緩解神經(jīng)元損傷的作用[5]，但其機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究定志小丸成分對(duì)阿爾茲海默病模型小鼠的作用及其作用機(jī)制。

抗氧化能力不能完全清除體內(nèi)氧自由基就會(huì)激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS 可以攻擊生物膜使膜脂過氧化，過氧化產(chǎn)物會(huì)損傷生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[12]。8-OHDG 是DNA 中鳥嘌呤堿基第8 位碳原子被活性氧自由基攻擊而產(chǎn)生的一種氧化性加合物[13]。MAO 是存在于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等機(jī)體細(xì)胞中的一類催化酶，既能夠催化單胺類遞質(zhì)的代謝，使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少，也能增加氧自由基的生成，加劇神經(jīng)功能損害[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，阿爾茲海默病模型小鼠的ROS、8-OHDG 和MAO 的含量比正常組小鼠都增加，符合阿爾茲海默病病理表現(xiàn)。經(jīng)過人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和自噬抑制劑組的干預(yù)后，其氧化應(yīng)激相關(guān)因子都有所減少，提示定志小丸成分對(duì)阿爾茲海默病模型小鼠的氧化應(yīng)激具有一定的抑制作用。

阿爾茲海默病發(fā)生神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵證據(jù)是阿爾茲海默病大腦中促炎細(xì)胞因子負(fù)荷增加[15]。腦組織炎癥反應(yīng)，釋放TNF-α 等炎性因子損傷大腦神經(jīng)元，導(dǎo)致認(rèn)知功能下降[16]。IL-6 屬于促炎因子，IL-10 屬于內(nèi)源性的抗炎介質(zhì)[17]。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與正常組比較，模型組的TNF-α 和IL-6 含量增加，IL-10 含量減少，提示阿爾茲海默病小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)。給予人參皂苷Rb3、β-細(xì)辛醚和自噬抑制劑的阿爾茲海默病模型小鼠，TNF-α 和IL-6 含量減少，IL-10 含量增加，這說(shuō)明各給藥組都具有一定抗炎作用。

Beclin-1 是啟動(dòng)自噬小體的關(guān)鍵因子[18]。研究發(fā)現(xiàn)自噬泡中富含淀粉樣前體蛋白、Aβ 及γ-分泌酶，誘導(dǎo)自噬可引起 Aβ 增多[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿爾茲海默病模型小鼠的Beclin-1 表達(dá)較高，提示阿爾茲海默病小鼠處于自噬激活狀態(tài)，經(jīng)過人參皂苷Rb3 組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合組和自噬抑制劑組干預(yù)的模型小鼠，它們的Beclin-1 表達(dá)都顯著減少，這說(shuō)明定志小丸成分對(duì)阿爾茲海默病模型小鼠具有一定抑制自噬的作用。PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路參與了細(xì)胞生理過程（如生長(zhǎng)、增殖等）的調(diào)控[20]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑組的抗氧化和抗炎也較為顯著，而Akt 抑制劑組的促炎和激活氧化反應(yīng)尤為突出，這提示定志小丸成分可能具有激活A(yù)kt 來(lái)減緩神經(jīng)元損傷和自噬的作用。

綜上所述，定志小丸有效成分對(duì)阿爾茲海默病模型小鼠具有保護(hù)神經(jīng)元的作用，表現(xiàn)為抗氧化應(yīng)激和抑制神經(jīng)炎癥，其機(jī)制可能是通過激活A(yù)kt 通路來(lái)降低細(xì)胞自噬的激活程度。