茍志敏，袁方均

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院 普外科，湖北 十堰 442000）

胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是胃腸道最常見的間質(zhì)來源腫瘤，占所有胃腸道腫瘤的1%～2%［1］。GIST 被認(rèn)為起源于Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（ICC），胃腸道的起搏細(xì)胞。GIST 可發(fā)生在整個胃腸道的任何地方，其中約60% 發(fā)生于胃，約30% 發(fā)生于小腸，約5%發(fā)生于十二指腸，約2%發(fā)生于結(jié)腸及闌尾，約4%發(fā)生于直腸，約1%發(fā)生于食管［2］。與其他上皮來源腫瘤不同，腫瘤大小以及核分裂象是評價GIST 危險度的兩個最為重要的病理特征，但僅靠以上兩個病理特征還不能準(zhǔn)確評價GIST 的惡性程度［3-4］。

目前普遍的認(rèn)知是基因突變在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮主要作用，但實際上也有其他的一些因素發(fā)揮了重要的作用［5-6］，因此，筆者希望能夠發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物用于預(yù)測GIST 的惡性程度和臨床進(jìn)程。自SASH1（SAM and SH3 domain containing 1）基因被發(fā)現(xiàn)以來，隨著研究的加深，發(fā)現(xiàn)該基因可能具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能，一些研究集中于其與多種實體瘤的關(guān)聯(lián)［7］。SASH1 屬于SLY 家族，包括SASH1、SLY1（淋巴細(xì)胞表達(dá)的含SH3 結(jié)構(gòu)域）和SLY2（或HACS1、NASH1）。所有進(jìn)化保守的SLY 家族成員都包含兩個蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用區(qū)，一個SH3（Src 同源域3）域和一個SAM（無菌α 基序）域。由于這些結(jié)構(gòu)特征，SASH1 在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用；其中一個作用涉及與肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用和刺激細(xì)胞-基質(zhì)粘附［8-10］。既往研究表明，SASH1 與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的一些重要過程緊密相關(guān)。ZELLER 等［7］發(fā)現(xiàn)，在6 個乳腺癌細(xì)胞系中，SASH1 mRNA 的表達(dá)顯著降低或完全缺失。ZELLER 等還發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小和預(yù)后與SASH1 下調(diào)程度相關(guān)，此外，在原發(fā)性甲狀腺腫瘤中也觀察到SASH1 表達(dá)顯著降低［7,11］。并且有研究發(fā)現(xiàn)SASH1 表達(dá)的降低或缺失與其他惡性腫瘤的侵襲性生長、轉(zhuǎn)移以及低生存率都存在相關(guān)性［12-17］。然而，SASH1 在間質(zhì)細(xì)胞來源腫瘤中是否發(fā)揮著類似的作用以及SASH1 表達(dá)與GIST 患者預(yù)后之間的關(guān)系尚不清楚。本研究的目的是為了評估SASH1 在GIST 的表達(dá)，并闡明SASH1 表達(dá)與GIST 風(fēng)險分類以及臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集了2017 年至2021 年間國藥東風(fēng)總醫(yī)院胃腸外科共74 份患者來源的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）胃腸間質(zhì)瘤組織樣本。臨床數(shù)據(jù)（包括年齡、性別、腫瘤大小、核分裂象）和其他信息均來自每位患者的醫(yī)療記錄。采用2013 版中國胃腸道間質(zhì)瘤病理診斷治療共識推薦的NIH2008年改良版對腫瘤的危險度進(jìn)行分級。獲得樣本的患者在手術(shù)前均未接受放療、新輔助化療或免疫治療。所有參與本研究的患者均獲得書面知情同意書。所有方法和方案均按照國藥東風(fēng)總醫(yī)院的相關(guān)指南和規(guī)定執(zhí)行。這項工作得到了國藥東風(fēng)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

脫蠟：將準(zhǔn)備好的石蠟組織切片（3μm）置于60℃溫箱中約烘烤2 h，然后于二甲苯中脫蠟，通過分級酒精再水合，在3% 過氧化氫中浸泡15 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。在10 nmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中壓力蒸煮4 min，然后將載玻片與10%正常山羊血清在室溫下預(yù)孵育30 min，以減少非特異性反應(yīng)。隨后，PBS 潤洗3 min×3 后滴加鼠抗人SASH1 抗體（Sigma 公司，1∶500），4℃過夜。PBS 潤洗3 min×3 后滴加Envision 二抗（GeneTech），37℃孵育30 min，最后用DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）染色，去離子水終止顯色，蘇木素復(fù)染20 s，鹽酸酒精分化5 s；自來水沖洗15 min 返藍(lán)；中性樹脂封片。采用已知的免疫染色陽性玻片用作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

每張載玻片檢查五個視圖，在×400 放大率下，每個視圖觀察100 個細(xì)胞。由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生根據(jù)陽性細(xì)胞的分布、強度和百分比對SASH1 表達(dá)進(jìn)行分級，并對每張玻片染色結(jié)果取得一致意見。SASH1 的表達(dá)通常分為四級：陰性（0%）、弱陽性（≤30%）、中等陽性（≤60%）和強陽性（＞60%）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理。計數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SASH1 在GIST 中的表達(dá)存在差異性

對74 例GIST 的石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，SASH1 均表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，且表達(dá)量存在明顯的差異，其中33 例為高表達(dá)，而剩余41 例為低表達(dá)。見圖1。

圖1 腫瘤組織及相應(yīng)正常組織中SASH1 的表達(dá)

2.2 GIST 中SASH1 的表達(dá)水平與臨床病理因素之間的關(guān)系

對SASH1 的表達(dá)強弱與GIST 的病理特征以及危險度進(jìn)行相關(guān)分析顯示，SASH1 的高表達(dá)與較多的核分裂象呈負(fù)相關(guān)（r=0.404,P=0.033）；SASH1 在極低或低風(fēng)險GIST 患者中的表達(dá)高于中等或高風(fēng)險GIST 患者（r=0.250,P=0.028）；SASH1的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及腫瘤大小之間均無相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

表1 SASH1 表達(dá)水平與GIST 的臨床病理因素的關(guān)系（例）

3 討論

胃腸間質(zhì)瘤通常在生物學(xué)行為和預(yù)后方面都展現(xiàn)出很大的異質(zhì)性和不可預(yù)測性，且大部分GIST 在完全切除后仍有復(fù)發(fā)和彌漫性生長的可能，并具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。大約50% 的胃和非胃GIST 在腫瘤完全切除后5 年內(nèi)復(fù)發(fā)。近年來，隨著醫(yī)療水平的進(jìn)一步提高，通過手術(shù)切除和靶向藥物（伊馬替尼）的聯(lián)合治療大大提高了GIST 患者的生存時間，但仍有許多患者死于腫瘤的局部復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故識別其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素極為重要。先前的研究已經(jīng)提供了足夠的證據(jù)證明SASH1 代表了一種新的候選腫瘤標(biāo)志物。SASH1 由兩個SAM 結(jié)構(gòu)域和一個SH3 結(jié)構(gòu)域組成，它們參與信號適配器蛋白或支架因子，被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。SH3 結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸的基序結(jié)合［18-19］，兩個相關(guān)蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點長度為10 個氨基酸［20］。SAM 結(jié)構(gòu)域可以通過自結(jié)合或與其他蛋白質(zhì)的SAM 結(jié)構(gòu)域相互作用來介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用［21-22］。SAM 結(jié)構(gòu)域還可以介導(dǎo)Smaug 蛋白和mRNA 之間的結(jié)合，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［23］。鑒于上述發(fā)現(xiàn)，SASH1被認(rèn)為會影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這種推測已在評 估U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞［24］、A549 人肺腺癌細(xì)胞［17］、A-375 黑色素瘤細(xì)胞［25］和MG-63 骨肉瘤細(xì)胞［26］的研究中得到證實。然而，這些研究都沒有研究SASH1 在GIST 中表達(dá)的相關(guān)臨床意義。

在這項研究中，筆者使用免疫組化方法檢測了GIST 樣本以及相應(yīng)的正常組織中SASH1 蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)SASH1 在腫瘤中的表達(dá)低于相應(yīng)鄰近正常組織和手術(shù)切緣的表達(dá)，在GIST 中，低SASH1 表達(dá)與患者的風(fēng)險分級具有相關(guān)性，且隨著腫瘤的惡性程度進(jìn)一步提高，SASH1 表達(dá)顯著降低。與前人研究中使用的方法相比，筆者在實驗和分析中使用的方法有兩個優(yōu)點：首先，TMA的使用允許對所有樣本進(jìn)行統(tǒng)一評估，從而能夠創(chuàng)建用于評估不同組織中染色強度和陽性細(xì)胞百分比的可比標(biāo)準(zhǔn)；其次，使用大樣本GIST 患者進(jìn)行分析可以提高相對可信度。但本研究仍有局限性，由于主要采用回顧性觀察，因此結(jié)果可能缺乏普遍適用性，這需要進(jìn)一步研究SASH1 的確切功能，如構(gòu)建質(zhì)粒，以證實筆者的發(fā)現(xiàn)和假設(shè)：GIST 中SASH1 表達(dá)降低預(yù)示著預(yù)后不良。

綜上所述，筆者認(rèn)為SASH1 可以被視為一種新的生物標(biāo)記物和一個有希望的GIST 治療靶點。