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        大麻二酚對急性放射性肺損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究

        2022-08-25 06:34:24武忠寶呂東陽柳云恩
        臨床軍醫(yī)雜志 2022年8期
        關(guān)鍵詞:組肺放射性低劑量

        武忠寶, 閻 英, 徐 瑩, 呂東陽, 柳云恩

        1.沈陽藥科大學(xué),遼寧 沈陽 110016;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 放療科,遼寧 沈陽 110016

        放射治療是一種應(yīng)用廣泛且有效的非手術(shù)治療方法。 超過50%的肺癌患者在病程中至少接受過一次的放射治療[1],但放射治療常會造成放射性肺損傷,主要表現(xiàn)為急性放射性肺炎和纖維化[2]。有研究發(fā)現(xiàn),放射會造成肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而誘導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞聚集在組織損傷部位[3]。 這些炎癥細(xì)胞會產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子,如轉(zhuǎn)化生長因子-β、干擾素(interferon,INF)-γ 和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-13 等,從而聚集更多的炎癥細(xì)胞,破壞細(xì)胞間的緊密連接,過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,最終導(dǎo)致肺纖維化[4-5]。 目前,放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制尚不明確,且缺乏有效的治療手段,尋找新的可減輕放射性肺損傷的有效手段是亟待解決的難題之一。大麻二酚(cannabidiol,CBD)是從大麻中提取的一種無毒成分,具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激的能力[6-8]。 近年來,歐美國家在非精神活性成分大麻提取物CBD 的藥理研究和藥物開發(fā)應(yīng)用方面取得了較大進(jìn)展,純CBD 的制備已用于腫瘤、急慢性疼痛、風(fēng)濕性疾病、精神類疾病、多發(fā)性硬化癥和兒童癲癇的治療[9-12]。 CBD 的用藥安全性具有保障,但CBD 在放射性肺損傷中的作用卻少見報道。 本研究通過構(gòu)建放射性急性肺損傷動物模型,腹腔注射CBD,旨在闡明CBD 對放射性急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 現(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物與分組 40 只健康雄性SD 大鼠(6 ~8 周齡,體質(zhì)量280 ~300 g)購自本溪長生生物科技公司。 大鼠飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實驗室,實驗室溫度為22℃~24℃,相對濕度40% ~70%,12 h 晝夜交替。 大鼠可自由飲水、飲食。 經(jīng)過7 d 環(huán)境適應(yīng)后,將40 只將大鼠隨機(jī)分成對照組、放射組、CBD 低劑量組(15 mg/kg)和CBD高劑量組(30 mg/kg),每組各10 只。 所有實驗操作和實驗方案經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會審批通過。

        1.2 放射性急性肺損傷動物模型制備 采用10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉,麻醉過程中密切關(guān)注大鼠行為和呼吸變化,待肌肉完全松弛后固定在自制泡沫板上,腹部向上,在泡沫板上畫好標(biāo)記。麻醉后,立即送至Phillips CT 模擬定位機(jī)下模擬定位,CT 圖像通過網(wǎng)絡(luò)以DICOM 格式傳輸至Elekta Monaco 治療計劃系統(tǒng),在TPS 上對大鼠肺部進(jìn)行勾畫并生成放射治療計劃。 按TPS 制定計劃行直線加速器單次照射20 Gy。 照射結(jié)束待大鼠恢復(fù)行動能力后送至動物實驗室繼續(xù)飼養(yǎng)。

        1.3 給藥方式及取材 照射結(jié)束后第2 天開始,每天同一時間測量并記錄大鼠的體質(zhì)量。 CBD 低劑量組和CBD 高劑量組大鼠分別腹腔注射15 mg/kg 和30 mg/kg 的CBD,連續(xù)注射6 d。 腹腔注射時傾斜進(jìn)針,使藥物進(jìn)入腹腔避免刺破腸腔,整個過程不需要麻醉。 取大鼠血液,在EP 管中室溫靜置1 h以上,3 000 r/min 離心10 min,取血清并做好標(biāo)記。3%苯巴比妥鈉麻醉后處死大鼠。

        1.4 組織病理學(xué)觀察 肺組織用10%中性甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋,然后制成3 ~4 μm 切片。將切片攤鋪并在室溫下烘焙過夜。 自然干燥后,用蘇木精-伊紅(HE)對切片進(jìn)行染色,并在顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

        1.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗 采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測肺組織IL-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的濃度。 在450 nm 波長處測定IL-1β、IL-6 和TNF-α 在微板閱讀器中的濃度,生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,繪制最佳密度值與標(biāo)準(zhǔn)濃度的關(guān)系圖,計算并測定樣品濃度的曲線方程和r 值。

        1.6 蛋白免疫印跡法 通過添加冷蛋白裂解物和蛋白酶抑制劑,從冷凍的肺組織中提取總蛋白。 用BCA 法測定各組大鼠的總蛋白濃度。 組織蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。 膜用TBST 清洗3 次,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,用TBST 清洗,參照Marker 切割。 添加 一 抗(IL-1β、 IL-4、 IL-6、 IL-17、 TNF-α、 IREα、MDA5、CHOP、Semaphorin 7α、AHSG 和Uteroglobin)在4℃孵育過夜。 用TBST 清洗3 次,每次10 min。加入二抗反應(yīng)液,在室溫下孵育2 h,然后用TBST清洗3 次,每次10 min。 采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影,置于化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)(伯樂,美國)中進(jìn)行掃描曝光。 采用Image J 軟件測量灰度值,以相應(yīng)的內(nèi)部參數(shù)作為測量和分析標(biāo)準(zhǔn)。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和Fisher 精確檢驗。 以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果 對照組大鼠肺組織未見明顯改變,放射組大鼠肺組織明顯水腫、變性/壞死、炎癥細(xì)胞浸潤,而CBD 低劑量組和CBD高劑量組放射導(dǎo)致的急性肺損傷明顯改善。 見圖1。

        圖1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果(HE×200)

        2.2 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平比較 與對照組比較,放射組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯升高(P <0.05);與放射組比較,CBD 低劑量組和CBD 高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯降低(P<0.05)。 見圖2。

        圖2 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平

        2.3 各組大鼠肺組織炎癥因子蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較,放射組肺組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17 和TNF-α 蛋 白 表 達(dá) 明 顯 增 加(P <0.05);與放射組比較,CBD 低劑量組和CBD 高劑量組肺組織IL-4、IL-6、IL-17 和TNF-α 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與放射組比較,CBD 高劑量組肺組織IL-1β 蛋白表達(dá)明顯降低(P < 0.05)。見圖3。

        2.4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較,放射組肺組織IREα、MDA5 和CHOP 蛋白表達(dá)明顯增加(P <0.05);與放射組比較,CBD 高劑量組肺組織IREα、MDA5 和CHOP 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 見圖4。

        2.5 各組大鼠炎癥浸潤調(diào)控關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較,放射組大鼠炎癥浸潤調(diào)控蛋白Semaphorin 7α、AHSG 和Uteroglobin 表達(dá)明顯增加(P<0.05);與放射組比較,CBD 高劑量組肺組織Semaphorin 7α、AHSG 和Uteroglobin 蛋白表達(dá)明顯降低(P <0.05);與放射組比較,CBD 低劑量組肺組織Semaphorin 7α 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖5。

        3 討論

        放射性肺損傷常見于肺癌、食管癌及其他胸部腫瘤的放射治療中,易造成早期急性放射性肺炎及晚期肺纖維化[13]。 有研究發(fā)現(xiàn),放射治療4 ~24 h內(nèi),肺組織常出現(xiàn)非特異性的急性反應(yīng),受損的肺組織和內(nèi)皮細(xì)胞會吸引巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子[14]。 本研究發(fā)現(xiàn),放射導(dǎo)致大鼠血清炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯增加,同時肺組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17 和TNF-α 蛋白表達(dá)也明顯增加,提示放射可以造成血清和組織炎癥因子表達(dá)水平升高。

        圖3 各組大鼠肺組織炎癥因子蛋白表達(dá)水平

        圖4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)水平

        圖5 各組大鼠炎癥浸潤調(diào)控關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平

        CBD 作為非甾體類抗炎藥,通過刺激多種特異性介質(zhì)被動停止促炎介質(zhì),增加了免疫炎癥細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡,阻止信號激活,刺激炎癥消退。有研究報道,CBD 可抑制牙齦假單胞菌誘導(dǎo)的IL-12p40、IL-6、IL-8 和TNF-α 的釋放,同時提高抗炎細(xì)胞因子IL-10 水平[15]。 而另有研究發(fā)現(xiàn),CBD可降低足底注射弗氏完全佐劑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)大鼠模型血清IL-1β、IL-10 和IFN-γ 水平,提高IL-6 表達(dá)[16]。 這提示,CBD 對不同動物模型的抗炎效果并不完全一致。 此外,CBD 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV-2 細(xì)胞中NF-κB 的激活,但不能抑制MAPKs 的激活,從而阻斷脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[17]。 本研究發(fā)現(xiàn),放射可以造成肺組織氧化應(yīng)激蛋白IREα、MDA5 和CHOP 表達(dá)增高,炎癥浸潤調(diào)節(jié)蛋白Semaphorin7α、AHSG 和Uteroglobin 表達(dá)增高,而CBD 可以顯著降低放射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,并改善炎癥浸潤蛋白表達(dá)。 有研究發(fā)現(xiàn),CBD 直接針對線粒體并保護(hù)關(guān)鍵的線粒體功能,包括氧化還原調(diào)節(jié)、鈣攝取、膜電位和生物能量學(xué)調(diào)節(jié),這些功能在催產(chǎn)素/鐵死亡誘導(dǎo)后被破壞。 CBD 的這些保護(hù)作用部分通過促進(jìn)內(nèi)源性抗氧化防御和激活A(yù)MP 激活的蛋白激酶信號實現(xiàn)[18]。 而CBD 類似物在抑制中性粒細(xì)胞滲透方面發(fā)揮了與強(qiáng)的松龍相當(dāng)?shù)挠行Э寡鬃饔肹19]。 此外,在Thp-1 巨噬細(xì)胞中,CD36僅被CBD 上調(diào),與αTan 或αTAR 共同作用可降低CD36 的表達(dá)。 這些結(jié)果提示,CBD 可以改善放射性導(dǎo)致的急性肺損傷,可能與其抗炎和抗氧化活性有關(guān)。

        綜上所述,CBD 對放射性急性肺損傷有保護(hù)作用,其作用可能通過降低炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激以及改變炎癥調(diào)控蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

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