王 欽 姚 燕

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通 226001；2.上藥控股南通有限公司，江蘇南通 226001

替考拉寧臨床可用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和腸球菌感染的治療，適應(yīng)證主要是膿毒癥、膿毒性關(guān)節(jié)炎、嗜中性粒細(xì)胞減少、膿毒性心內(nèi)膜炎、骨髓炎急性發(fā)作等，且已知的不良反應(yīng)發(fā)生率低。替考拉寧口服無效，與萬古霉素比較，其半衰期明顯延長至80～168 h，在體內(nèi)約97%以原型經(jīng)腎排泄，其余經(jīng)肝臟代謝?，F(xiàn)有的替考拉寧血藥濃度檢測方法主要有：高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法、微生物檢定法、熒光偏振免疫法、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法等，其中，HPLC 法具有操作簡單、靈敏度高、專屬性好、成本較低廉等優(yōu)勢。治療非嚴(yán)重細(xì)菌感染替考拉寧的穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度需達(dá)到10～25 μg/ml，方可達(dá)到治療效果，而治療嚴(yán)重細(xì)菌感染則需達(dá)到15～30 μg/ml。此外，替考拉寧需在開始給藥時(shí)給予足夠的負(fù)荷劑量，再給予維持劑量，這樣可迅速達(dá)到較穩(wěn)定的血藥谷濃度。因此，在臨床實(shí)踐中應(yīng)合理監(jiān)測其血藥濃度以保證療效。本研究采用內(nèi)標(biāo)法優(yōu)化HPLC 法檢測血漿中替考拉寧的血藥濃度，旨在為臨床制定更合理的給藥方案提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 試藥

替考拉寧對照品（效價(jià)：894 U/mg，中國食品藥品檢定研究院，批號：130374-201002）；哌拉西林鈉對照品（純度：98.0%，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：5C8OB-CA）；注射用替考拉寧[賽諾菲（北京）制藥有限公司，批號：CF20178，規(guī)格：0.2 g/支]；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；二氯甲烷、磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 超純水。

1.2 儀器

1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）（包括自動(dòng)進(jìn)樣器、真空脫氣機(jī)、四元泵、紫外檢測器、色譜工作站）；Diamonsil C色譜柱（美國Agilent 公司，4.6 mm×150 mm，5 μm）；VORTEX-5 型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Sorvall Stratos型高速離心機(jī)（德國Thermo 公司）；BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；GZ-1 型多用震蕩器（北京畢捷電機(jī)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（25∶75）（用磷酸溶液調(diào)整pH 值為2.8）；柱溫：30℃；流速：1.2 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：215 nm。

2.2 溶液的配制方法

2.2.1 替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取替考拉寧對照品100.00 mg，置50 ml 容量瓶內(nèi)，加入適量10%甲醇超聲溶解后稀釋至刻度，反復(fù)顛倒搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，使成2.00 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-20℃冰箱冷凍保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取哌拉西林鈉對照品76.53 mg，置50 ml 容量瓶內(nèi)，加超純水超聲溶解后稀釋至刻度，反復(fù)顛倒搖勻，得1.50 mg/ml 哌拉西林鈉內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取取儲(chǔ)備液1.0 ml，置10 ml容量瓶內(nèi)，加超純水超聲溶解后稀釋至刻度，反復(fù)顛倒搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得150.00 μg/ml 內(nèi)標(biāo)溶液，置于-20℃冰箱冷凍保存。

2.2.3 血樣的處理方法 量取空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿或質(zhì)控血漿樣品400 μl 置1.5 ml 離心管內(nèi)，加入50 μl“2.2.2”項(xiàng)下的內(nèi)標(biāo)溶液，再加入乙腈600 μl，渦旋震蕩2 min，離心半徑7 cm，離心轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心5 min 后得上清液。將上清液900 μl 移入另一個(gè)1.5 ml 離心管內(nèi)，加入二氯甲烷400 μl 萃取，渦旋震蕩2 min，離心半徑7 cm，離心轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心5 min 后得上清液。經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取上清液20 μl 進(jìn)樣。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)處理血樣，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，HPLC 圖譜見圖1。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿和質(zhì)控血漿樣品的替考拉寧（取其主要組分TA2-2 吸收峰）、內(nèi)標(biāo)峰形均良好，保留時(shí)間分別為7.3 min 和12.5 min。因此該方法的專屬性良好。色譜柱的理論板數(shù)10 295，分離度均＞1.5，拖尾因子分別為1.02 和1.03，符合《中華人民共和國藥典》的要求。

圖1 HPLC 色譜圖

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 吸取“2.2.1”項(xiàng)下的替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，加入空白血漿950 μl，配制成濃度為100 μg/ml 樣品A；吸取A 溶液500 μl，加入空白血漿500 μl，配制成濃度為50 μg/ml 樣品B；依照同法繼續(xù)稀釋樣品，得25.000、12.500、6.250、3.125 μg/ml 系列濃度樣品C、D、E、F。按“2.2.3”項(xiàng)處理血樣，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，以TA2-2 與內(nèi)標(biāo)峰面積比為橫坐標(biāo)（X），質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y，μg/ml），采用加權(quán)最小二乘法，得回歸方程：Y=11.295 386X-0.048 985（r=0.9987），在3.125～100.000 μg/ml 峰面積比與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 準(zhǔn)確度 吸取“2.2.1”項(xiàng)下的替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，加入空白血漿950 μl，配制成濃度為100 μg/ml樣品A；吸取A 溶液250 μl，加入空白血漿500 μl，配制成濃度為33.33 μg/ml 質(zhì)控樣品H；依照同法繼續(xù)稀釋樣品，得濃度為11.11、3.70 μg/ml 質(zhì)控樣品M、L，均平行制備5 份。按“2.2.3”項(xiàng)處理血樣，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，每日各檢測1 次，共檢測3 d，計(jì)算批內(nèi)及批間準(zhǔn)確度。計(jì)算公式為：相對誤差（relative error，RE）=（實(shí)測值/標(biāo)示值）×100%，見表1。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)及批間RE 均在85%～115%范圍內(nèi)，表明分析方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 批內(nèi)及批間準(zhǔn)確度（%）

2.3.4 精密度 取“2.3.3”項(xiàng)下的質(zhì)量濃度3.70、11.11、33.33 μg/ml 的低、中、高濃度質(zhì)控樣品L、M、H。按“2.2.3”項(xiàng)方法處理血樣，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，每日各檢測1 次，共檢測3 d，計(jì)算批內(nèi)及批間相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD），見表2。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)及批間RSD＞15%，表明分析方法的精密度良好。

表2 批內(nèi)及批間精密度（%）

2.3.5 提取回收率 取 “2.3.3” 項(xiàng)下的質(zhì)量濃度3.70、11.11、33.33 μg/ml 的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，測定得到的峰面積用Q 指代，取“2.2.1”項(xiàng)下的替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液加流動(dòng)相稀釋的質(zhì)量濃度3.70、11.11、33.33 μg/ml 的低、中、高質(zhì)量濃度的替考拉寧溶液樣品，測定得到的峰面積用P 指代，均平行制備5 份。按“2.2.3”項(xiàng)方法處理血樣，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，并計(jì)算提取回收率=（峰面積Q/峰面積P）×100%，見表3。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度樣品的替考拉寧和內(nèi)標(biāo)的提取回收率均在85%～115%范圍內(nèi)，符合要求。

表3 提取回收率結(jié)果（%，±s，n=5）

2.4 樣品測定

5 例患者靜脈滴注替考拉寧0.4 g/次，1 次/d，在第2 天給藥前30 min 和第6 天給藥前30 min，采集靜脈血2 ml，采用含乙二胺四乙酸（ethylene diamine te traacetic acid，EDTA）抗凝劑的無菌采血管保存血樣。按“2.2.3”項(xiàng)方法處理血樣，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，測定替考拉寧谷濃度，結(jié)果見表4。其中4 例患者的替考拉寧穩(wěn)態(tài)谷濃度在10～25 μg/ml 有效谷濃度范圍內(nèi)，另外1 例（編號2 患者）需及時(shí)調(diào)整劑量才能保證療效和用藥安全。

表4 5 例患者不同采血時(shí)機(jī)的替考拉寧谷濃度測定結(jié)果（μg/ml）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

與甲醇-水流動(dòng)相比較，乙腈-水流動(dòng)相可獲得更好的峰型和分離度。當(dāng)乙腈與水體積比為25∶75 時(shí)，替考拉寧與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為7.3、12.5 min，且此方法的分離度均＞1.5，能滿足基線分析的要求。在流動(dòng)相內(nèi)添加不同的離子對試劑可進(jìn)一步改善分離效果和峰型，如：乙酸銨、甲酸銨、磷酸二氫鉀等。結(jié)果表明，在水中加入0.01 mol/L 磷酸二氫鉀時(shí)峰型較好。流動(dòng)相的pH 值能影響替考拉寧和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間，當(dāng)pH 值較高時(shí)替考拉寧的保留時(shí)間較長，而內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間較短，因此選擇合適的pH 值為2.8。本研究最終選擇流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（25∶75）（用磷酸溶液調(diào)整pH 值為2.8）。

替考拉寧在215 nm 和240 nm 均有較強(qiáng)的紫外吸收峰，選擇以上兩種波長進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測波長為215 nm 時(shí)，替考拉寧和內(nèi)標(biāo)的峰形良好，血漿雜質(zhì)吸收較弱，對測定替考拉寧影響較?。粰z測波長為240 nm 時(shí)，血漿雜質(zhì)吸收雖弱，但替考拉寧的出峰較小，峰面積不如215 nm，此波長的檢測限和定量限不如215 nm 好。因此，本研究選擇215 nm 為最佳的檢測波長。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

內(nèi)標(biāo)法檢測替考拉寧血藥濃度的內(nèi)標(biāo)可選擇對羥基苯甲酸甲酯、哌拉西林鈉、苯巴比妥、香草醛、拉莫三嗪等。本研究除哌拉西林鈉外，其他內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均較短，容易和血漿樣品中的其他物質(zhì)混合，影響檢測結(jié)果，因此選擇哌拉西林鈉為內(nèi)標(biāo)。但由于臨床中可能會(huì)有同時(shí)使用替考拉寧與哌拉西拉鈉的患者，這樣的血樣可以用外標(biāo)法檢測。本研究經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，外標(biāo)法也可以滿足方法學(xué)的相關(guān)要求。

3.3 血漿樣品前處理溶劑的選擇

替考拉寧穩(wěn)定性雖好但極性較大，因此要選擇合適的萃取試劑。血漿樣本先采用乙腈沉淀蛋白后，本研究考察不同有機(jī)溶劑萃取的效果，有甲基叔丁基醚和二氯甲烷等，發(fā)現(xiàn)用二氯甲烷萃取樣品的分離度比甲基叔丁基醚更優(yōu)。所以本研究最終選擇二氯甲烷作為液-液萃取有機(jī)溶劑。

綜上所述，采用HPLC 法測定血漿中替考拉寧的血藥濃度，方法簡便可行，專屬性強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積比與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率等方法學(xué)指標(biāo)均符合《中華人民共和國藥典》要求。