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        miRNA-205-3p 在川崎病合并巨大冠脈瘤中的作用機(jī)制探討

        2022-08-24 07:45:06鄭洋張慧李曉惠張明明林瑤石琳
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2022年20期
        關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄冠脈引物

        鄭洋 張慧 李曉惠 張明明 林瑤 石琳

        首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科,北京 100020

        川崎病(Kawasaki disease,KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征,是一種血管炎癥綜合征,可累及全身多器官,以心血管后遺癥最為嚴(yán)重,包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈瘤、血栓形成及心肌梗死[1-3]。巨大冠脈瘤(giant coronary artery aneurysm,GCAA)是冠狀動(dòng)脈瘤最嚴(yán)重的類型,可持續(xù)存在并進(jìn)展,是導(dǎo)致KD 合并血栓形成及心肌梗死的最主要原因,嚴(yán)重危害兒童身心健康[4]。如何早期預(yù)警這些高危患兒并積極干預(yù)是目前亟待解決的臨床與科學(xué)問題。微RNA(microRNA,miRNA)是一類長度為18~25 個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼RNA,通過降解靶基因mRNA 或抑制mRNA 的翻譯發(fā)揮生物學(xué)功能[5-6]。近年來有關(guān)miRNA 的研究表明,部分異常表達(dá)的miRNA 與癌癥及心血管疾病密切相關(guān)[7-10]。有研究提示miRNA 可能成為KD 早期診斷標(biāo)志物[11],但有關(guān)miRNA 與GCAA 形成的相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究探索miRNA-205-3p 在KD 合并GCAA 發(fā)病中的作用機(jī)制,并在動(dòng)物模型上進(jìn)行驗(yàn)證,為GCAA 的早期診斷和發(fā)生機(jī)制探索提供新思路。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        1.1.1 研究對(duì)象 選取2018 年11 月至2021 年2 月于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院(以下簡稱“我院”)心內(nèi)科住院治療的KD 患兒36 例,其中KD 組30 例,KD 合并GCAA 組6 例。按頻數(shù)匹配同期年齡、性別的于我院體檢的健康對(duì)照兒童和明確病原的發(fā)熱對(duì)照患兒各20 例(KD 組及KD 合并GCAA 組∶健康對(duì)照組∶發(fā)熱對(duì)照組=1.8∶1∶1)。本研究通過我院倫理委員會(huì)審批(SHERLL2018020)。

        納入標(biāo)準(zhǔn):①川崎病患兒診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017 年美國心臟協(xié)會(huì)指南[3];②發(fā)熱患兒為經(jīng)呼吸道病毒7項(xiàng)檢測明確病原體的急性呼吸道感染患兒。排除標(biāo)準(zhǔn):川崎病患兒:①合并其他部位血管瘤;②臨床資料不完整;③家長拒絕參與研究。發(fā)熱患兒:①不明原因發(fā)熱患兒;②病毒感染累及下呼吸道患兒。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3~4 周齡C57BL/6 SPF 級(jí)健康雄性小鼠共12 只,體重(16.43±0.91)g,采購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006;合格證號(hào)No.110011211104810921],于屏障環(huán)境下飼養(yǎng),人工控溫22~26℃,室內(nèi)照明14 h∶10 h 明暗交替。符合我院動(dòng)物倫理要求。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 血液樣本采集 KD 組及KD 合并GCAA 組標(biāo)本采樣于患兒入院確診后,開始靜脈用人免疫球蛋白治療前,于清晨空腹留取靜脈血2 ml,置于EDTA 抗凝管,于4℃,1760 g 離心5 min,將上層血漿和下層血細(xì)胞分開收集于1.5 ml 無菌離心管中,于-80℃冰箱保存。健康對(duì)照組及發(fā)熱對(duì)照組于清晨空腹留取靜脈血2 ml,樣本處理同前。

        1.2.2 基因芯片分析及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)驗(yàn)證 通過基因芯片分析KD 組、KD 合并GCAA 組、健康對(duì)照組、發(fā)熱對(duì)照組(每組3 例)差異表達(dá)的miRNA。按照TRIzol(美國,Thermo,15596026)試劑說明提取總RNA;采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國,生工生物工程,B532451)進(jìn)行miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增;采用qPCR 試劑盒(中國,生工生物工程,B532461)進(jìn)行qPCR。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增體系:2×miRNA RT Solution Mix 10 μl、miRNA RT Enzyme Mix 2 μl、RNA 2 μl(總量約為2 μg)、RNase-Free Water 6 μl 制成反應(yīng)體系20 μl;反應(yīng)條件:37℃,60 min,85℃,5 min,4℃;qPCR 反應(yīng)體系:2×miRNA qPCR Master Mix 10 μl、miRNA 正向引物0.5 μl、miRNA 反向引物0.5 μl、cDNA 2 μl、ROX Referrence Dye(H)1 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反應(yīng)體系20 μl;qPCR 反應(yīng)條件:95℃,30 s 預(yù)變性;95℃,5 s 變性;60℃,30 s 退火/延伸;循環(huán)40 次,記錄反應(yīng)CT 值。使用2-△△Ct法計(jì)算miRNA 的相對(duì)表達(dá)量。人miRNA-205-3p 引物序列:正向引物為5’-CGCGGATTTCAGTGGAGTGAAGTTC-3’;反向引物為3’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-5’;內(nèi)參U6序列:正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向引物為3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’。

        1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過DIANA TOOLS-mir-Pathv.3、KEGG 分析查詢所有差異表達(dá)miRNA 的相關(guān)信號(hào)通路,分析與KD 組及KD 合并GCAA 組發(fā)生的相關(guān)通路。

        1.2.4 小鼠模型構(gòu)建及心臟組織mRNA 水平測定 選取3~4 周齡C57BL/6 SPF 級(jí)雄性小鼠12 只,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為KD 合并冠狀動(dòng)脈病變(coronary artery lesion,CAL)組及對(duì)照組,每組6 只。KD 合并CAL 組小鼠腹腔注射干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分(中國,CICC,6104)0.5 ml(濃度1 mg/ml),對(duì)照組注射磷酸鹽緩沖液0.5 ml;人工控溫22~26℃,室內(nèi)照明14 h∶10 h 明暗交替,自由飲水進(jìn)食。于第2 周麻醉后在超聲下觀察小鼠的冠脈擴(kuò)張情況;麻醉后處死小鼠,摘取心臟組織,制作病理切片并觀察冠脈情況,若周圍有炎癥細(xì)胞浸潤,證明造模成功[12]。其余心臟組織液氮速凍后置于-80℃保存。

        按照RNeasy Mini Kit 試劑盒(德國,Qiagen,74104)說明提取鼠心臟組織mRNA;采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大,Abm,G492)進(jìn)行mRNA 的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增;采用qPCR 試劑盒(加拿大,Abm,M-LR)進(jìn)行qPCR。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增體系:AccuRT Reaction Mix (4×) 2 μl、RNA 2 μl(總量約為2 μg)、RNase-Free Water 4 μl(定容至8 μl),于室溫靜置5 min,再加入AccuRT Reaction Stopper(5×) 2 μl,搖勻,加入5×All-In-One Rt Master Mix 4 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反應(yīng)體系20 μl;反應(yīng)條件:25℃,10 min,42℃,15 min,85℃,5 min,qPCR 反應(yīng)體系:EvaGreen 2×qPCR Master Mix 10 μl、mRNA 正向引物0.6 μl、mRNA 反向引物0.6 μl、cDNA 1 μl、RNase-Free Water 7.8 μl 制成反應(yīng)體系20 μl;反應(yīng)條件及表達(dá)量測量方法同“1.2.2”。mRNA-轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)引物序列:正向引物為5’-TTGCTTCAGCTCCA-CAGAGA-3’;反向引物為3’-TGGTTGTAGAGGGC-AAG GAC-5’;mRNA-SMAD5引物序列:正向引物為5’-GATTGTTGGGCTGGAAACAAG-3’;反向引物為3’ -CTCCATAGCACCCTTCTTCTTC-5’;內(nèi)參GAPDH 序列:正向引物為5’-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3’;反向引物為3’-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-5’。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 23.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t 檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示,比較采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 人口學(xué)信息

        本研究中共收集KD 患兒36 例,其中KD 組30 例,平均年齡(2.33±1.31)歲,男∶女=2∶1;KD 合并GCAA組6 例,平均年齡(1.28±0.54)歲,男∶女=2∶1;按頻數(shù)匹配健康對(duì)照組20 名,平均年齡(2.71±1.71)歲,男∶女=3∶1;發(fā)熱對(duì)照組20 例,平均年齡(2.96±1.42)歲,男∶女=2.3∶1(KD 組及KD 合并GCAA 組∶健康對(duì)照組∶發(fā)熱對(duì)照組=1.8∶1∶1)。各組年齡、性別比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),具有可比性。

        2.2 基因芯片分析

        通過基因芯片分析KD 組、KD 合并GCAA 組、健康對(duì)照組及發(fā)熱對(duì)照組,各組間差異表達(dá)>10 倍且P <0.05 的miRNA 共12 個(gè)?;蛐酒Y(jié)果見表1。

        2.3 各組miRNA-205-3p 表達(dá)量比較

        KD 組miRNA-205-3p 表達(dá)量高于健康對(duì)照組及發(fā)熱對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05);KD 合并GCAA 組miRNA-205-3p 表達(dá)量高于健康對(duì)照組、發(fā)熱對(duì)照組及KD 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見表2。

        表2 各組miRNA-205-3p 表達(dá)量比較[M(P25,P75)]

        2.4 生物信息學(xué)分析結(jié)果

        miRNA-205-3p 在MAPK 信號(hào)通路及TGF-β/SMAD5 信號(hào)通路中作用顯著。見表3、圖1~2。

        表3 miRNA-205-3p 部分相關(guān)通路及涉及靶基因

        2.5 小鼠模型心臟組織病理切片

        鏡下可見KD 合并CAL 組小鼠心臟冠狀動(dòng)脈周圍炎癥細(xì)胞增多;對(duì)照組小鼠無明顯炎癥細(xì)胞浸潤,證明造模成功。見圖3。

        2.6 TGF-β/SMAD5 信號(hào)通路在冠脈損傷小鼠心臟組織中的表達(dá)

        KD 合并CAL 組小鼠心臟組織TGF-β1 mRNA 表達(dá)量(3.93±2.42)高于對(duì)照組(1.42±1.23),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.272,P <0.05);KD 合并CAL 組小鼠心臟組織SMAD5 mRNA 表達(dá)量(2.98±1.53)高于對(duì)照組(1.05±0.34),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.040,P <0.05)。

        3 討論

        近年來,KD 的發(fā)病率有增高趨勢,成為兒童獲得性心臟疾病的主要病因。KD 合并GCAA 可能會(huì)引起血栓形成、瘤體破裂甚至猝死等嚴(yán)重結(jié)局[4],目前發(fā)生機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-205-3p 在KD 及KD 合并GCAA 患兒中表達(dá)水平明顯升高;經(jīng)生物信息分析和動(dòng)物模型驗(yàn)證,提示miRNA-205-3p 可能通過TGF-β/SMAD 通路參與KD 及GCAA 形成。

        miRNA-205-3p 可在多種RNA 信號(hào)軸中起作用[13]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA-205-3p 在膠質(zhì)瘤及胃癌中可通過TGF-β 調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換[14-15],提示miRNA-205-3p 通過TGF-β 信號(hào)通路在多種疾病中發(fā)揮病理作用。TGF-β 參與心血管系統(tǒng)多種生理和病理變化的調(diào)節(jié),如誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、纖維化和鈣化[16-17]。SMAD5 是一種受體激活型SMADs,可直接被TGF-β磷酸化激活并參與其信號(hào)通路的調(diào)控[18-19],其缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。Cho 等[20]針對(duì)SMAD5 的基因多態(tài)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與KD 相關(guān)的SNP 分型。

        TGF-β/SMAD5 信號(hào)通路可引發(fā)心臟結(jié)構(gòu)的病理變化:通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成和細(xì)胞環(huán)境的改變,引發(fā)病理變化[21-22]。當(dāng)TGF-β/SMAD5 表達(dá)升高時(shí),彈力板和膠原纖維彈性被破壞,血管壁收縮功能及強(qiáng)度下降,冠脈結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損,在高速?zèng)_擊的血流下,出現(xiàn)血管壁擴(kuò)張,最終導(dǎo)致KD 的病理改變;同時(shí),激活的TGF-β/SMAD 通路可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[23],TGF-β 可通過SMAD 通路,包括SMAD1/5 信號(hào)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換等一系列病理變化,改變細(xì)胞表型和功能,介導(dǎo)血管瘤的形成[24-27]。本研究通過構(gòu)建小鼠模型,驗(yàn)證了TGF-β/SMAD5 通路在KD 中的促進(jìn)作用。

        本研究的不足在于:KD 合并GCAA 的發(fā)病率較低,使病例數(shù)較少,如果有條件,可在擴(kuò)大GCAA 患兒樣本量的情況下再次驗(yàn)證;探索出的作用機(jī)制有待經(jīng)過后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證。

        綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在KD 及KD 合并GCAA 患兒中,miRNA-205-3p 的表達(dá)水平升高,提示miRNA-205-3p 可能作為KD 診斷及早期評(píng)估病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物,其作用機(jī)制可能通過TGF-β/SMAD5信號(hào)通路。該研究為KD 合并GCAA 的發(fā)病機(jī)制研究提供了新靶點(diǎn)。

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