鄭洋 張慧 李曉惠 張明明 林瑤 石琳

首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100020

川崎病（Kawasaki disease，KD）又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種血管炎癥綜合征，可累及全身多器官，以心血管后遺癥最為嚴(yán)重，包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈瘤、血栓形成及心肌梗死[1-3]。巨大冠脈瘤（giant coronary artery aneurysm，GCAA）是冠狀動(dòng)脈瘤最嚴(yán)重的類型，可持續(xù)存在并進(jìn)展，是導(dǎo)致KD 合并血栓形成及心肌梗死的最主要原因，嚴(yán)重危害兒童身心健康[4]。如何早期預(yù)警這些高危患兒并積極干預(yù)是目前亟待解決的臨床與科學(xué)問題。微RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為18～25 個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼RNA，通過降解靶基因mRNA 或抑制mRNA 的翻譯發(fā)揮生物學(xué)功能[5-6]。近年來有關(guān)miRNA 的研究表明，部分異常表達(dá)的miRNA 與癌癥及心血管疾病密切相關(guān)[7-10]。有研究提示miRNA 可能成為KD 早期診斷標(biāo)志物[11]，但有關(guān)miRNA 與GCAA 形成的相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究探索miRNA-205-3p 在KD 合并GCAA 發(fā)病中的作用機(jī)制，并在動(dòng)物模型上進(jìn)行驗(yàn)證，為GCAA 的早期診斷和發(fā)生機(jī)制探索提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2018 年11 月至2021 年2 月于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院（以下簡稱“我院”）心內(nèi)科住院治療的KD 患兒36 例，其中KD 組30 例，KD 合并GCAA 組6 例。按頻數(shù)匹配同期年齡、性別的于我院體檢的健康對(duì)照兒童和明確病原的發(fā)熱對(duì)照患兒各20 例（KD 組及KD 合并GCAA 組∶健康對(duì)照組∶發(fā)熱對(duì)照組=1.8∶1∶1）。本研究通過我院倫理委員會(huì)審批（SHERLL2018020）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①川崎病患兒診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017 年美國心臟協(xié)會(huì)指南[3]；②發(fā)熱患兒為經(jīng)呼吸道病毒7項(xiàng)檢測明確病原體的急性呼吸道感染患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：川崎病患兒：①合并其他部位血管瘤；②臨床資料不完整；③家長拒絕參與研究。發(fā)熱患兒：①不明原因發(fā)熱患兒；②病毒感染累及下呼吸道患兒。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4 周齡C57BL/6 SPF 級(jí)健康雄性小鼠共12 只，體重（16.43±0.91）g，采購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006；合格證號(hào)No.110011211104810921]，于屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，人工控溫22～26℃，室內(nèi)照明14 h∶10 h 明暗交替。符合我院動(dòng)物倫理要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血液樣本采集 KD 組及KD 合并GCAA 組標(biāo)本采樣于患兒入院確診后，開始靜脈用人免疫球蛋白治療前，于清晨空腹留取靜脈血2 ml，置于EDTA 抗凝管，于4℃，1760 g 離心5 min，將上層血漿和下層血細(xì)胞分開收集于1.5 ml 無菌離心管中，于-80℃冰箱保存。健康對(duì)照組及發(fā)熱對(duì)照組于清晨空腹留取靜脈血2 ml，樣本處理同前。

1.2.2 基因芯片分析及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）驗(yàn)證 通過基因芯片分析KD 組、KD 合并GCAA 組、健康對(duì)照組、發(fā)熱對(duì)照組（每組3 例）差異表達(dá)的miRNA。按照TRIzol（美國，Thermo，15596026）試劑說明提取總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國，生工生物工程，B532451）進(jìn)行miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增；采用qPCR 試劑盒（中國，生工生物工程，B532461）進(jìn)行qPCR。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增體系：2×miRNA RT Solution Mix 10 μl、miRNA RT Enzyme Mix 2 μl、RNA 2 μl（總量約為2 μg）、RNase-Free Water 6 μl 制成反應(yīng)體系20 μl；反應(yīng)條件：37℃，60 min，85℃，5 min，4℃；qPCR 反應(yīng)體系：2×miRNA qPCR Master Mix 10 μl、miRNA 正向引物0.5 μl、miRNA 反向引物0.5 μl、cDNA 2 μl、ROX Referrence Dye（H）1 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反應(yīng)體系20 μl；qPCR 反應(yīng)條件：95℃，30 s 預(yù)變性；95℃，5 s 變性；60℃，30 s 退火/延伸；循環(huán)40 次，記錄反應(yīng)CT 值。使用2-△△Ct法計(jì)算miRNA 的相對(duì)表達(dá)量。人miRNA-205-3p 引物序列：正向引物為5’-CGCGGATTTCAGTGGAGTGAAGTTC-3’；反向引物為3’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-5’；內(nèi)參U6序列：正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物為3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過DIANA TOOLS-mir-Pathv.3、KEGG 分析查詢所有差異表達(dá)miRNA 的相關(guān)信號(hào)通路，分析與KD 組及KD 合并GCAA 組發(fā)生的相關(guān)通路。

1.2.4 小鼠模型構(gòu)建及心臟組織mRNA 水平測定 選取3～4 周齡C57BL/6 SPF 級(jí)雄性小鼠12 只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為KD 合并冠狀動(dòng)脈病變（coronary artery lesion，CAL）組及對(duì)照組，每組6 只。KD 合并CAL 組小鼠腹腔注射干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分（中國，CICC，6104）0.5 ml（濃度1 mg/ml），對(duì)照組注射磷酸鹽緩沖液0.5 ml；人工控溫22～26℃，室內(nèi)照明14 h∶10 h 明暗交替，自由飲水進(jìn)食。于第2 周麻醉后在超聲下觀察小鼠的冠脈擴(kuò)張情況；麻醉后處死小鼠，摘取心臟組織，制作病理切片并觀察冠脈情況，若周圍有炎癥細(xì)胞浸潤，證明造模成功[12]。其余心臟組織液氮速凍后置于-80℃保存。

按照RNeasy Mini Kit 試劑盒（德國，Qiagen，74104）說明提取鼠心臟組織mRNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大，Abm，G492）進(jìn)行mRNA 的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增；采用qPCR 試劑盒（加拿大，Abm，M-LR）進(jìn)行qPCR。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增體系：AccuRT Reaction Mix (4×) 2 μl、RNA 2 μl（總量約為2 μg）、RNase-Free Water 4 μl（定容至8 μl），于室溫靜置5 min，再加入AccuRT Reaction Stopper(5×) 2 μl，搖勻，加入5×All-In-One Rt Master Mix 4 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反應(yīng)體系20 μl；反應(yīng)條件：25℃，10 min，42℃，15 min，85℃，5 min，qPCR 反應(yīng)體系：EvaGreen 2×qPCR Master Mix 10 μl、mRNA 正向引物0.6 μl、mRNA 反向引物0.6 μl、cDNA 1 μl、RNase-Free Water 7.8 μl 制成反應(yīng)體系20 μl；反應(yīng)條件及表達(dá)量測量方法同“1.2.2”。mRNA-轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）引物序列：正向引物為5’-TTGCTTCAGCTCCA-CAGAGA-3’；反向引物為3’-TGGTTGTAGAGGGC-AAG GAC-5’；mRNA-SMAD5引物序列：正向引物為5’-GATTGTTGGGCTGGAAACAAG-3’；反向引物為3’ -CTCCATAGCACCCTTCTTCTTC-5’；內(nèi)參GAPDH 序列：正向引物為5’-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3’；反向引物為3’-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-5’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)信息

本研究中共收集KD 患兒36 例，其中KD 組30 例，平均年齡（2.33±1.31）歲，男∶女=2∶1；KD 合并GCAA組6 例，平均年齡（1.28±0.54）歲，男∶女=2∶1；按頻數(shù)匹配健康對(duì)照組20 名，平均年齡（2.71±1.71）歲，男∶女=3∶1；發(fā)熱對(duì)照組20 例，平均年齡（2.96±1.42）歲，男∶女=2.3∶1（KD 組及KD 合并GCAA 組∶健康對(duì)照組∶發(fā)熱對(duì)照組=1.8∶1∶1）。各組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。

2.2 基因芯片分析

通過基因芯片分析KD 組、KD 合并GCAA 組、健康對(duì)照組及發(fā)熱對(duì)照組，各組間差異表達(dá)＞10 倍且P ＜0.05 的miRNA 共12 個(gè)?；蛐酒Y(jié)果見表1。

2.3 各組miRNA-205-3p 表達(dá)量比較

KD 組miRNA-205-3p 表達(dá)量高于健康對(duì)照組及發(fā)熱對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；KD 合并GCAA 組miRNA-205-3p 表達(dá)量高于健康對(duì)照組、發(fā)熱對(duì)照組及KD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組miRNA-205-3p 表達(dá)量比較[M（P25，P75）]

2.4 生物信息學(xué)分析結(jié)果

miRNA-205-3p 在MAPK 信號(hào)通路及TGF-β/SMAD5 信號(hào)通路中作用顯著。見表3、圖1～2。

表3 miRNA-205-3p 部分相關(guān)通路及涉及靶基因

2.5 小鼠模型心臟組織病理切片

鏡下可見KD 合并CAL 組小鼠心臟冠狀動(dòng)脈周圍炎癥細(xì)胞增多；對(duì)照組小鼠無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，證明造模成功。見圖3。

2.6 TGF-β/SMAD5 信號(hào)通路在冠脈損傷小鼠心臟組織中的表達(dá)

KD 合并CAL 組小鼠心臟組織TGF-β1 mRNA 表達(dá)量（3.93±2.42）高于對(duì)照組（1.42±1.23），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.272，P ＜0.05）；KD 合并CAL 組小鼠心臟組織SMAD5 mRNA 表達(dá)量（2.98±1.53）高于對(duì)照組（1.05±0.34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.040，P ＜0.05）。

3 討論

近年來，KD 的發(fā)病率有增高趨勢，成為兒童獲得性心臟疾病的主要病因。KD 合并GCAA 可能會(huì)引起血栓形成、瘤體破裂甚至猝死等嚴(yán)重結(jié)局[4]，目前發(fā)生機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-205-3p 在KD 及KD 合并GCAA 患兒中表達(dá)水平明顯升高；經(jīng)生物信息分析和動(dòng)物模型驗(yàn)證，提示miRNA-205-3p 可能通過TGF-β/SMAD 通路參與KD 及GCAA 形成。

miRNA-205-3p 可在多種RNA 信號(hào)軸中起作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-205-3p 在膠質(zhì)瘤及胃癌中可通過TGF-β 調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換[14-15]，提示miRNA-205-3p 通過TGF-β 信號(hào)通路在多種疾病中發(fā)揮病理作用。TGF-β 參與心血管系統(tǒng)多種生理和病理變化的調(diào)節(jié)，如誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、纖維化和鈣化[16-17]。SMAD5 是一種受體激活型SMADs，可直接被TGF-β磷酸化激活并參與其信號(hào)通路的調(diào)控[18-19]，其缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。Cho 等[20]針對(duì)SMAD5 的基因多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與KD 相關(guān)的SNP 分型。

TGF-β/SMAD5 信號(hào)通路可引發(fā)心臟結(jié)構(gòu)的病理變化：通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成和細(xì)胞環(huán)境的改變，引發(fā)病理變化[21-22]。當(dāng)TGF-β/SMAD5 表達(dá)升高時(shí)，彈力板和膠原纖維彈性被破壞，血管壁收縮功能及強(qiáng)度下降，冠脈結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損，在高速?zèng)_擊的血流下，出現(xiàn)血管壁擴(kuò)張，最終導(dǎo)致KD 的病理改變；同時(shí)，激活的TGF-β/SMAD 通路可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[23]，TGF-β 可通過SMAD 通路，包括SMAD1/5 信號(hào)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換等一系列病理變化，改變細(xì)胞表型和功能，介導(dǎo)血管瘤的形成[24-27]。本研究通過構(gòu)建小鼠模型，驗(yàn)證了TGF-β/SMAD5 通路在KD 中的促進(jìn)作用。

本研究的不足在于：KD 合并GCAA 的發(fā)病率較低，使病例數(shù)較少，如果有條件，可在擴(kuò)大GCAA 患兒樣本量的情況下再次驗(yàn)證；探索出的作用機(jī)制有待經(jīng)過后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在KD 及KD 合并GCAA 患兒中，miRNA-205-3p 的表達(dá)水平升高，提示miRNA-205-3p 可能作為KD 診斷及早期評(píng)估病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物，其作用機(jī)制可能通過TGF-β/SMAD5信號(hào)通路。該研究為KD 合并GCAA 的發(fā)病機(jī)制研究提供了新靶點(diǎn)。