徐 浩 楊 杰 袁 園

1.南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院 江蘇省如皋市人民醫(yī)院腫瘤化療科，江蘇如皋 226500；2.南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院 江蘇省如皋市人民醫(yī)院腫瘤放療科，江蘇如皋 226500

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，惡性細(xì)胞能夠從原發(fā)腫瘤散播并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，具有發(fā)病隱匿、術(shù)后易復(fù)發(fā)及死亡率高的特點[1]。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，我國結(jié)直腸癌患者每年以4.2%的速度遞增，且5 年生存率低于20%[2-3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，早期診斷有助于及時采取有效治療方案，降低死亡率。層粘連蛋白β1（lamininβ1，LAMβ1）是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族中的成員之一，參與基底膜組成及細(xì)胞黏附、增殖、分化等過程，能夠促進(jìn)腫瘤惡性表型的發(fā)生[4]。有研究報道，結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個多基因、多步驟、多階段性的演變過程，癌變過程涉及基因的異常表達(dá)[5]。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體4（actin-related protein 2/3 complex 4，ARPC4）是由7 個亞單位組成的復(fù)合體，能夠促進(jìn)肌動蛋白單體核化裝配形成微絲，參與磷脂酰肌醇3-激酶信號通路調(diào)節(jié)，促進(jìn)與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲[6]。然而，LAMβ1 和ARPC4 在結(jié)直腸癌患者中的變化及診斷價值尚不清楚。鑒于此，本研究探討結(jié)直腸癌患者癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平及其臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年3 月至2021 年3 月江蘇省如皋市人民醫(yī)院收治的74 例結(jié)直腸癌患者的癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本。其中，結(jié)直腸癌患者男42 例，女32 例；年齡20～76 歲，平均（51.85±8.37）歲；分化程度：高分化14 例，中分化39 例，低分化21 例；臨床TNM 分期：Ⅰ期32 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期6 例。本研究經(jīng)江蘇省如皋市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸癌患者符合《結(jié)直腸癌規(guī)范化診療》[7]中結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)組織病理學(xué)確診，且入組前接受任何治療；年齡20～78 歲；知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙；合并血液系統(tǒng)疾?。缓喜⒕窦膊?；合并急慢性腸炎、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)疾??；合并急性泌尿感染、結(jié)核菌感染等感染性疾病。

1.2 檢測方法

實時熒光定量PCR 檢測：按照試劑盒說明書提取癌組織和癌旁組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen 公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生cDNA，在聚合酶作用下擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，進(jìn)行40 個循環(huán)。采用Mygo 熒光定量PCR 儀（北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行檢測，設(shè)置U6 為內(nèi)參對照，每個反應(yīng)3 個復(fù)孔，計算平均值，采用2-ΔΔCt法獲得的LAMβ1、ARPC4 mRNA 相對表達(dá)量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列

免疫印跡法測定：取患者組織樣本置于離心管中，加入組織裂解液勻漿，12 000 r/min 離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清，采用試劑盒測定蛋白水平，并定量，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，隔天加入二抗，37℃下孵育2 h，最后加發(fā)光底物曝光顯示目的條帶，掃描膠片，采用凝膠成像儀分析軟件測定蛋白條帶密度值，目的蛋白與內(nèi)參的比值為蛋白表達(dá)相對定量。

所有患者均以病理學(xué)檢查結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，均進(jìn)行內(nèi)鏡活組織檢查，手術(shù)切除活檢標(biāo)本，制作石蠟切片，并進(jìn)行HE 染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察，腫瘤穿透黏膜肌層并到達(dá)黏膜下層即可診斷為結(jié)直腸癌[8]。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較癌組織和癌旁組織LAMβ1、ARPC4 mRNA表達(dá)。②比較癌組織和癌旁組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)。③分析LAMβ1 聯(lián)合ARPC4 診斷結(jié)直腸癌的價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用配對t 檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗；采用受試者操作曲線（receiver operating curve，ROC）分析LAMβ1聯(lián)合ARPC4 蛋白表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的價值。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 mRNA 表達(dá)比較

結(jié)直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 mRNA 表達(dá)水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。見表2。

表2 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 mRNA 表達(dá)比較（）

表2 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 mRNA 表達(dá)比較（）

注 LAMβ1：層粘連蛋白β1；ARPC4：肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體4

2.2 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 蛋白表達(dá)比較

結(jié)直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。見表3。

表3 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 蛋白表達(dá)比較（）

表3 癌組織和癌旁組織LAMβ1 及ARPC4 蛋白表達(dá)比較（）

注 LAMβ1：層粘連蛋白β1；ARPC4：肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體4

2.3 癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的價值

ROC 分析顯示，癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的最佳截斷點分別為1.02 和0.94，靈敏度分別為78.38%和81.08%，特異度分別為82.43%和78.37%，曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.815、0.804，約登指數(shù)分別為0.608、0.595，兩者聯(lián)合的特異度、AUC 和約登指數(shù)分別為98.65%，0.873 和0.757。見表4、圖1。

表4 癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的價值

圖1 LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的ROC

3 討論

結(jié)直腸癌是一種發(fā)病率高、死亡率高的惡性腫瘤，然而，患者早期癥狀不明顯，臨床確診時已進(jìn)入晚期，錯過最佳治療時機(jī)[9-12]。臨床早期診斷有助于提高救治率，近年來，關(guān)于結(jié)直腸癌的早期診斷逐漸引起醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注[13]。腫瘤標(biāo)志物是惡性腫瘤的診斷參考指標(biāo)，已被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床診斷，癌胚抗原是臨床常用的惡性腫瘤標(biāo)志物，在監(jiān)測結(jié)直腸癌診斷以及預(yù)后預(yù)測中具有重要價值，然而，癌胚抗原診斷結(jié)直腸癌的特異度較低，影響臨床診斷結(jié)果[14-16]。因此，臨床亟須尋找有效診斷結(jié)直腸癌的方法。

本研究中結(jié)直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，且結(jié)直腸癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織，提示LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要影響。LAMβ1 是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種非膠原糖蛋白，是細(xì)胞間質(zhì)中基底膜的主要成分，在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移及基底膜相互作用中發(fā)揮重要作用，其主要通過腫瘤細(xì)胞表面的LAMβ1 受體與基底膜中層LAMβ1相互識別與結(jié)合完成[17]。此外，腫瘤細(xì)胞對于基底膜的降解、黏附和破壞是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，LAMβ1 通過整合素的信號介導(dǎo)可以參加細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、遷移和血管生成等活動[18]。結(jié)直腸癌患者LAMβ1 蛋白表達(dá)水平升高可能與腫瘤細(xì)胞降解以及破壞基底膜和腫瘤組織中的大量新生毛細(xì)血管細(xì)胞膜有關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，ARPC4 是肌動蛋白組裝成核劑，肌動蛋白組成微絲構(gòu)成細(xì)胞骨架，是細(xì)胞運(yùn)動偽足的主要成分，能夠促進(jìn)微絲合成作用，參與細(xì)胞運(yùn)動[20]。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維組成，參與細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動等重要生命活動，ARPC4對于腫瘤細(xì)胞骨架功能及結(jié)構(gòu)改變影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[21]。ARPC4 通過促進(jìn)惡性腫瘤在基質(zhì)中運(yùn)動，為腫瘤細(xì)胞的浸潤提供有利條件[22]。臨床研究證實，ARPC4 下調(diào)后腫瘤細(xì)胞系遷移能力出現(xiàn)明顯降低，降低ARPC4表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的侵襲能力[23]。李合等[24]研究報道，結(jié)直腸癌患者血清LAMβ1 水平異常升高。王亞儒等[25]研究報道，結(jié)直腸癌患者癌組織中ARPC4 表達(dá)水平升高，與本研究結(jié)果相符。ROC分析顯示，癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平分別以1.02 和0.94 為最佳截斷點時，均可作為診斷結(jié)直腸癌的敏感指標(biāo)，且兩者聯(lián)合時診斷價值更高。任海亮等[26]研究報道，ARPC4與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床檢測ARPC4 可作為預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的敏感指標(biāo)。因此，臨床檢測結(jié)直腸癌患者癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平變化，可作為監(jiān)測結(jié)直腸癌發(fā)生的敏感指標(biāo)，兩者聯(lián)合診斷能夠提高準(zhǔn)確率。

綜上，結(jié)直腸癌患者癌組織LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)水平異常升高，兩者均可作為診斷結(jié)直腸癌的敏感指標(biāo)，兩者聯(lián)合診斷價值更高。然而，本研究病例選取有限，研究結(jié)果可能存在一定偏倚，仍需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心研究，進(jìn)一步證實癌組織LAMβ1、ARPC4蛋白表達(dá)水平在結(jié)直腸癌中的診斷價值，并深入探究LAMβ1、ARPC4 蛋白表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)制。