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        lncRNAs H19 在糖尿病骨關節(jié)炎軟骨下骨中的表達及其意義

        2022-08-24 07:45:10康少英郭洪生王培霞王振興詹金華張英民王華軍
        中國醫(yī)藥導報 2022年20期
        關鍵詞:下骨熒光素酶軟骨

        薛 偉 康少英 郭洪生 王培霞 王振興 詹金華 張英民 王華軍

        1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院骨三科,河北邯鄲 056001;2.暨南大學第一臨床醫(yī)學院 暨南大學附屬第一醫(yī)院骨關節(jié)與運動醫(yī)學中心,廣東廣州 510630

        骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨重塑為特征的退行性疾病[1-3]。代謝綜合征與OA 密切相關,我國糖尿病患者人數(shù)預計到2035 年將增加到1.43 億[4]。糖尿病患者患有OA 的概率是非糖尿病患者的3.8 倍[5],但糖尿病對于OA 的影響機制仍然未知。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要調控作用[6-8]。有研究證明lncRNAs H19 參與軟骨下骨成骨分化和骨再生的調控過程[9-10]。同時,有研究證明糖尿病會導致H19 的表達異常[11],因此闡明H19 在糖尿病OA 中的異常表達及其對軟骨下骨造成的影響,為臨床治療糖尿病OA 提供理論基礎和治療靶點。

        1 材料與方法

        1.1 標本來源

        選取2017 年1 月至2019 年6 月于河北省邯鄲市中心醫(yī)院就診行膝關節(jié)置換術治療的糖尿病OA患者(DM-OA 組)與非糖尿病OA 患者(OA 組),各3 例,以及對照組3 名(同期體檢)。樣本均取自脛骨平臺病變部位軟骨下骨。OA 診斷按照Kellgren &Lawrence[12]分級為Ⅲ級或Ⅳ級,所有患者年齡50~80 歲。取樣符合河北省邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會標準并得到了批準,且取樣獲得患者或家屬的知情同意。

        1.2 獲取軟骨下骨

        取得脛骨平臺標本后,沖洗標本,并在裝有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B 混合溶液(三抗)(購自北京謹明生物科技有限公司,PS0752)的磷酸鹽緩沖液的無菌平皿中浸泡10 min,2~3 次。將標本上表面的軟骨清理干凈,獲得的即是軟骨下骨標本。

        1.3 qRT-PCR 檢測lncRNAs 及miRNA 表達水平

        為檢測lncRNAs H19 及miR-141、miR-22 表達水平,合成對應的探針引物進行qRT-PCR 反應。反應體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10.5 μl(購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司,RR820A)、PCR 正反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl、單蒸水8 μl,總反應體系20 μl。反應條件:50℃2 min,95℃10 min,95℃15 s,60℃1 min,共40 個循環(huán)。-20℃保存。以NADPH 為內參對照,取三復孔進行平均,對照組設為100%,對DM-OA組和OA組進行相對定量。H19正向引物:5’-CGTTCCTTTAGTCTCCTGAC-3’,反向引物:5’-AGT-CCGTGTTCCAAGTCC-3’;miR-141正向引物:5’-TCCATCTTCCAGTGCAGTGTR-3’,反向引物:5’-GAACATGTCTGCGTATCT-3’;miR-22 正向引物:5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’,反向引物:5’-AGUUCUUCAACUGGCAGCUUUU-3’;NADPH 正向引物:5’-CGGACAGGATTGACAGATTGATAGC-3’,反向引物:5’-TGCCAGAGTCTCGTTCGTTATCG-3’。

        1.4 熒光素酶報道基因

        設計引物擴增lncRNAs H19 的3’UTR 區(qū)序列,將其克隆到PmirGLO 載體,構建PmirGLO-H19-WT質粒;設計相應的H19 突變質粒,構建PmirGLOH19-MUT 質粒。GenePharm 吉瑪公司合成miR-22、miR-141 的mimic 及inhibitor 片段,轉染相應的質粒及miR-22、miR-141 片段。48 h 后裂解細胞,檢測熒光素酶活性。

        1.5 qRT-PCR 及蛋白免疫印跡檢測β-catenin 與Runx2 表達水平

        采用qRT-PCR 及蛋白免疫印跡檢測β-catenin與Runx2 表達水平。反應體系:SYBR Premix Ex TaqⅡ10.5 μl、PCR 反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl、單蒸水8 μl,總反應體系20 μl。反應條件:50℃2 min,95℃10 min,95℃15 s,60℃1 min,共40 個循環(huán)。-20℃保存。以內參為對照,取三復孔進行平均,對照組設為100%,對DM-OA 組和OA 組進行相對定量。參照蛋白免疫印跡檢測步驟進行操作,依次選取目的條帶,分析得出光密度數(shù)值,以β-catenin 蛋白與NADPH 密度的比值,計算出各組目的蛋白的相對表達量。

        1.6 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 各組軟骨下骨組織中H19 及miR-141、miR-22表達水平比較

        DM-OA 組的H19 表達水平高于OA 組及對照組,miR-141、miR-22 表達水平低于OA 組及對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);OA 組的H19 表達水平高于對照組,miR-141、miR-22 表達水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖1。

        圖1 各組軟骨下骨組織中H19 及miR-141、miR-22 表達水平比較(n=3)

        2.2 熒光素酶報道基因檢測H19 靶向吸附miR-141、miR-22 情況

        過表達H19 WT 和miR-141、miR-22 片段后,熒光素酶報道的熒光信號明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.01)。miR-141 mimic、miR-22 mimic 相似物對突變質粒的熒光信號不產(chǎn)生影響,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。見圖2。

        圖2 熒光素酶報道基因檢測H19 靶向吸附miR-141、miR-22 情況

        2.3 各組軟骨下骨組織中β-catenin、Runx2 的mRNA及蛋白表達水平比較

        DM-OA 組的β-catenin mRNA、Runx2 mRNA 表達水平高于OA 組及對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);OA 組的β-catenin mRNA、Runx2 mRNA 表達水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。DMOA 組的β-catenin 蛋白、Runx2 蛋白 表達水平高于OA 組及對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);OA 組的β-catenin 蛋白、Runx2 蛋白表達水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖3。

        圖3 各組軟骨下骨組織中β-catenin、Runx2 的mRNA 及蛋白表達水平比較(n=3)

        3 討論

        OA 是中老年人最常見的慢性退化性的關節(jié)疾病[13-14],其中軟骨下骨的病變是OA 發(fā)生及發(fā)展的重要影響因素[15-17]。然而,關于OA 以及糖尿病OA 的發(fā)病機制卻一直未能被完全揭示[18]。近年來發(fā)現(xiàn),lncRNAs 在諸多生命活動及疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[19-20]。lncRNAs H19 位于人類染色體11p15.5,是最著名印記基因之一[21-23]。研究表明,miR-141 和miR-22 兩種miRNA 過表達可以導致人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)中βcatenin 的表達水平顯著降低[24]。而H19 可以拮抗這兩個miRNA 的功能,最終激活Wnt/β-catenin 信號通路,促進hMSCs 向成骨細胞分化,從而促進骨生成。本研究結果顯示,OA 患者的軟骨下骨中l(wèi)ncRNAs H19 表達量要高于非OA 患者,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),H19可以通過海綿作用吸附miR-141 和miR-22,且通過熒光素酶報道基因及突變實驗證明了H19 可靶向調控miR-141 和miR-22。同時,糖尿病患者軟骨下骨中l(wèi)ncRNAs H19 以及成骨細胞標志物的表達量均要高于非糖尿病患者,這不僅僅解釋了糖尿病患者OA的發(fā)病率較高、病情發(fā)展更加迅速外,同時也進一步提示lncRNAs H19 和β-catenin 之間確實存在一定的關系。

        Wnt 信號通路是多細胞真核生物在進化過程中一條非常保守的信號通路。當抑制Wnt/β-catenin 通路后,胞質內β-catenin 濃度增加并進入細胞核內與T 細胞轉錄因子/淋巴增強因子形成復合體,通過與DNA 結合,進而誘導c-myc、cyclinD 和Runx2 等靶基因的轉錄,使成骨細胞的細胞周期由G1期進入S 期,而成骨細胞的分化增殖也得到增強[25]。lncRNAs H19導致β-catenin 上調,通過依賴β-catenin 的經(jīng)典Wnt信號通路促進hMSCs 向成骨細胞分化,導致OA 軟骨下骨中骨吸收和骨生成的平衡失調,骨生成增多,導致OA 患者軟骨峽谷的硬化,加重OA 的進程。

        本研究表明,lncRNAs H19 在OA 患者軟骨下骨中的表達水平高于非OA 患者,H19 可直接海綿吸附抑制miR-141 和miR-22,上調β-catenin 蛋白,激活Wnt/β-catenin 通路,從而使OA 軟骨下骨中的骨生成增多,軟骨下骨硬化。同時本研究創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn),糖尿病會進一步上調OA 患者軟骨下骨中H19 的表達,這可能是糖尿病患者OA 發(fā)病率高的原因,同時也會加速疾病的發(fā)展,為研究OA、糖尿病OA 的發(fā)病機制以及臨床治療提供了實驗基礎和新思路。

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