唐群華 母小琴 黃仕蘭 唐志康 廉曉玲

湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，湖南懷化 418000

宮頸癌嚴(yán)重威脅女性的生命和健康[1]，中晚期患者由于淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致臨床療效不佳[2]。上皮鈣黏素（E-cadherin，E-cad）是重要的上皮細(xì)胞固有黏附分子，也是上皮性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的抑制分子[3-4]。C-末端Src 蛋白（C-terminal Src protein，c-Src）/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）作為互助型復(fù)合體具有重要的信號調(diào)控功能[5-6]。本研究以宮頸癌組織及細(xì)胞系為研究對象，探討c-Src/FAK/E-cad 通路在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinomas，CSCC）組織標(biāo)本30 例、正常宮頸（normal cervical，NC）組織標(biāo)本30例，以上石蠟標(biāo)本均來源于2019 年1 月至2020 年12 月湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科，其中CSCC 中Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期8 例。另選取我院術(shù)中采集的CSCC、NC 組織各1 例。宮頸癌Caski 細(xì)胞系來源于我院中心實(shí)驗(yàn)室。c-Src 抑制劑（AZD0530）購自碧云天生物技術(shù)公司，分子量542 kD。宮頸癌Caski 細(xì)胞系分為Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組，Caski 組不進(jìn)行處理，Caski+c-Src 抑制劑組加入c-Src 抑制劑，使用濃度為2.7 nmol/L[7]。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色觀察CSCC 與NCT 中E-cad 陽性率。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法，按試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司，KIT-9720）說明書操作。步驟如下：CSCC、NC 石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟切片，加一抗，濃度為c-Src（1∶500），4℃冰箱過夜后加入二抗（1∶500）；辣根過氧化物酶法顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。結(jié)果判斷[8]：①按染色深度評分。無染色記為0 分，淺黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，深棕色記為3 分。②按陽性細(xì)胞比率評分。陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)＜10%記為0 分；10%～＜25%記為1 分；25%～＜50%記為2 分；≥50%記為3 分。③2 項(xiàng)評分相加。0～1 分為陰性，2 分為弱陽性，3～4 分為陽性，5～6 分為強(qiáng)陽性。陽性率=（弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性）/總數(shù)×100%。

1.3 E-cad 表達(dá)情況與CSCC 臨床病理特征關(guān)系

收集30 例CSCC 患者的臨床病理特征，包括年齡、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obste-trics，F(xiàn)IGO）分期、分化程度、復(fù)發(fā)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分析其與E-cad 表達(dá)情況的關(guān)系。

1.4 Western blot 檢測c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達(dá)水平

采用Western blot 觀察CSCC、NC 組織中c-Src、FAK、E-cad 蛋白的表達(dá)情況。CSCC、NC 組織剪碎研磨，加裂解液；4℃，12000 g 條件下離心30 min，吸取上清液為蛋白樣品；水浴變性；SDS-PAGE 電泳；將分離膠中蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上；麗春紅染色；脫脂奶粉封閉；將PVDF 膜放入雜交袋中，加封閉液和一抗（c-Src、FAK、E-cad 濃度均為1∶1000），冰箱中過夜；加封閉液和二抗，濃度1∶1000；掃描凝膠并照相。Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組無需前處理，直接檢測即可。實(shí)驗(yàn)重交3 次。

1.5 侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)

侵襲實(shí)驗(yàn)：首先將Matrigel 膠與無血清培養(yǎng)基按1∶100 混合，浸泡小室，在上腔加100 μl 基質(zhì)膠，紫外線消毒殺菌過夜；上腔加200 μl，下腔加600 μl 無血清培養(yǎng)基；收集細(xì)胞，密度為2×105個/ml，上下腔中加入200 μl 細(xì)胞，并加入含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，48 h 后取出，加無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計數(shù)10 個高倍視野中細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)不需要Matrigel膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

采用流式細(xì)胞術(shù)觀察c-Src 抑制劑對Caski 細(xì)胞系凋亡的影響。Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組分別用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成懸液，保留沉淀加入緩沖液，將細(xì)胞吹打均勻，加入Annexin V 及染色劑，混勻，計算機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重交3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSCC、NC 組織標(biāo)本中E-cad 陽性率比較

NC 組織標(biāo)本的E-cad 陽性率（76.7%，23/30）高于CSCC 組織標(biāo)本（26.7%，8/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.017，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 宮頸鱗癌、正常宮頸組織標(biāo)本中上皮鈣黏素陽性率比較（免疫組織化學(xué)染色，200×）

2.2 CSCC 患者臨床病理特征與E-cad 的表達(dá)的關(guān)系

E-cad 表達(dá)與CSCC 患者的FIGO 分期、分化程度、復(fù)發(fā)情況相關(guān)聯(lián)（P ＜0.05）。見表1。

表1 CSCC 患者臨床病理特征與E-cad 的表達(dá)的關(guān)系（例）

2.3 CSCC、NC 組織中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達(dá)水平比較

CSCC 組織中c-Src、FAK 表達(dá)水平高于NC 組織，E-cad 表達(dá)水平低于NC 組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 NC 組織、CSCC 中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

2.4 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較

Caski+c-Src 抑制劑組侵襲、遷移細(xì)胞計數(shù)均低于Caski 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較（個/10 HP，±s，n=3）

表2 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較（個/10 HP，±s，n=3）

2.5 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細(xì)胞凋亡率的比較

Caski+c-Src 抑制劑組細(xì)胞凋亡率為（14.6±0.8）%，Caski 組細(xì)胞凋亡率為（5.1±0.2）%，Caski+c-Src 抑制劑組細(xì)胞凋亡率高于Caski 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.953，P ＜0.001）。

2.6 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組c-Src、FAK、E-cad蛋白表達(dá)水平比較

Caski+c-Src 抑制劑組c-Src、FAK 蛋白表達(dá)水平低于Caski 組，E-cad 蛋白表達(dá)水平高于Caski 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

3 討論

E-cad 缺失能夠誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[9-11]。在宮頸癌浸潤及轉(zhuǎn)移灶中大部分E-cad 表達(dá)缺失[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cad 在NC 組織中高于CSCC，且E-cad 表達(dá)與腫瘤分化程度、FIGO分期、復(fù)發(fā)有關(guān)，提示E-cad 表達(dá)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，E-cad 表達(dá)和功能受c-Src/FAK 的調(diào)控[13]。c-Src 在調(diào)控細(xì)胞生長增殖、黏附等方面發(fā)揮重要作用[14-17]。FAK 是一種非受體酪氨酸蛋白激酶，是整合素信號的中心分子[18]；而整合素介導(dǎo)FAK 活化對于細(xì)胞播散和遷移至關(guān)重要[19]。

c-Src 和FAK 以c-Src/FAK 復(fù)合體形式于人體中存在并發(fā)揮作用[20]。c-Src/FAK 復(fù)合體參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、遷移等病理生理過程[21-22]。在頭頸鱗癌、肺癌中，均存在FAK 高表達(dá)[23-25]。FAK 增高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力[26-27]。FAK 在宮頸癌中高表達(dá)，且與宮頸癌惡性程度有關(guān)[28]。

本研究結(jié)果顯示，CSCC 組織中c-Src、FAK 表達(dá)增高，E-cad 表達(dá)下調(diào)，加入c-Src 抑制劑后，宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力下降，凋亡增多，宮頸癌細(xì)胞中c-Src、FAK 下調(diào)，E-cad 表達(dá)上調(diào)。

綜上，CSCC 中，c-Src 表達(dá)下調(diào)可引起FAK 下調(diào)和E-cad 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致宮頸癌侵襲和遷移能力下降，可能與細(xì)胞凋亡增多有關(guān)，對于宮頸癌靶向治療具有重要意義。