溫國琴

(朔州師范高等專科學(xué)校,山西 朔州 036002)

0 引 言

纖維素是一種巨大的可再生資源,也是植物秸稈、木材、紙張、棉麻等的主要組分。自然界中能降解和利用纖維素的微生物種類繁多,真菌、細(xì)菌、放線菌屬即部分酵母菌等主要的微生物類群中都含有。微生物對天然纖維素的快速降解與能量轉(zhuǎn)化不僅僅是人類自然界中發(fā)生碳素能量轉(zhuǎn)化的主要組成環(huán)節(jié),也是天然土壤中的微生物進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化代謝的主要能量來源,且可以利用天然纖維素降解微生物及其代謝產(chǎn)生的纖維素酶把天然纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為食品、飼料、醫(yī)藥、化工原料等產(chǎn)品,具有廣闊的應(yīng)用前景,對于不同種類纖維素分解菌的產(chǎn)酶活力和不同條件下產(chǎn)酶活性的研究同樣具有重要的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品;平板培養(yǎng)基(CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基1,CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基2、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基);液體培養(yǎng)基;粗酶液;3,5二硝基水楊酸(DNS)顯色液;0.1mol/L p H=4.6 CH3COOH-CH3COONa緩沖溶液;羧甲基纖維素鈉溶液;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0mg/m L)。

1.2 方 法

1.2.1 取樣與處理

去除表層3cm土壤后采集下層土樣。同時在距土壤表層10cm到15cm范圍內(nèi)埋下濾紙片,等待一周后采集土樣,用無菌離心管盛裝,稱取10g土樣加入100m L無菌水,充分混合搖勻,得到10-1土壤稀釋液,逐步稀釋制成10-2,10-3,10-4,10-5不同稀釋濃度的土壤懸液。

1.2.2 纖維素分解菌初步篩選

吸取上述不同梯度的稀釋液200μl,涂布于CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基及羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上。每個稀釋梯度下各涂布三個平板,在37℃左右恒溫培養(yǎng)一周,而后仔細(xì)觀察CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基上的菌落周圍是否形成透明圈。對羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上的菌落,剛果紅染色10min后用1mol/L的NaCl脫色15min后仔細(xì)觀察培養(yǎng)基上透明圈的形成情況。

1.2.3 纖維素分解菌的純化

挑取羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上經(jīng)染色后產(chǎn)生透明圈的菌落,在新的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基進(jìn)行劃線處理,編上菌落序號之后,放入37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一周。

1.2.4 富集培養(yǎng)

將純化培養(yǎng)基上長出的菌落與原菌落對比,確定無雜菌污染后用接種環(huán)挑取多個菌落于加入20μL無菌水離心管中混勻,將20μL的菌液接種于用于富集的液體培養(yǎng)基中,37℃160 r/min條件下震蕩3d。

1.2.5 菌種鑒定

吸取10μL的菌液于EP管中,再加入30μL的25m M NaOH溶液,在98℃下加熱10min,而后取5μL加入到PCR體系中,進(jìn)行DNA擴(kuò)增,經(jīng)DNA凝膠電泳技術(shù)測定后判斷擴(kuò)增成功,則送去測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析,得出菌的種屬?；蛑苯犹羧【溆陔x心管中,直接加到PCR體系中,進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6 產(chǎn)酶條件的研究[1]

1.2.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取1.0mg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0,0.16,0.32,0.48,0.64,0.8m L,分別加蒸餾水至體系為0.8m L,各加0.6m L DNS顯色液,煮沸5min,冷卻后定容至10m L。在540nm波長下檢測光密度的數(shù)值,以光密度值為縱坐標(biāo),對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的含量作為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。[5]

1.2.6.2 DNS法測定CMC酶活

取10m L小試管,加入CMC-Na溶液0.6m L置于40℃水浴中預(yù)熱2～3min后加入0.2m L粗酶液,保溫30min后馬上加入0.6m L DNS顯色液,沸水浴煮沸5min,冷卻后定容至10m L,用分光光度計(jì)在540nm處比色測定記錄各管的吸光度A1。

對照組空白樣的處理中,加入所有試劑后直接沸水浴煮沸5min,冷卻后定容至10m L,用分光光度計(jì)在540nm處比色測定記錄吸光度A0?？鄢瞻字岛蟮玫降奈庵蹈鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到還原糖含量。

羧甲基纖維素酶活(Carboxy Methyl Cellulase,CMCase)的測定[4]:一個酶活單位(International Unit,IU)定義為在40℃,p H=4.6條件下,1min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生1μg還原糖所需酶量。

CMC酶活力的計(jì)算公式如式(1):

1.2.6.3 液體培養(yǎng)基初始p H對產(chǎn)酶的影響

調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的p H,p H值使用NaOH和KCl調(diào)節(jié)在5,5.5,6,6.5,7。

1.2.6.4 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源不變,碳源分別采用飼料秸稈粉、濾紙、葡萄糖、蔗糖、CMC(10g/L),在p H值為5.5,37℃,160 r/min條件下振蕩連續(xù)培養(yǎng)3 d,再進(jìn)行CMC酶活力的分析測定。

1.2.6.5 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源保持不變,氮源分別采用蛋白胨、硫酸銨、草酸銨、尿素、檸檬酸(5g/L),在p H值為5.5,37℃,160 r/min條件下振蕩連續(xù)培養(yǎng)3 d,進(jìn)行CMC酶活力的分析測定。

2 結(jié)果分析

2.1 平板培養(yǎng)基篩選效果

在相同條件下接種土壤懸液。CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基1中菌落生長緩慢,菌落很小,不易于觀察和測量;CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基2中菌株生長較快,菌落直徑明顯增大,但水解圈小,平板顏色深不易觀察;羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上菌株生長速度較快,染色后纖維素分解菌水解圈大且非常清晰。

2.2 菌種篩選

通過觀察菌落的直徑與經(jīng)過纖維素分解產(chǎn)生的水解圈直徑的比值判斷篩選得到纖維素分解能力較好的3株菌株:1,4,5,見表1。比較得到的4種具有一定的分解纖維素能力的菌株中1號菌的分解能力最強(qiáng)。

表1 3株菌株纖維素分解能力比較

2.3 菌種的形態(tài)特征觀察

如圖1,1號菌菌落較小,直徑0.6mm,菌落呈 圓形,表面微微突出隆起,為不透明米白色或者灰白色,菌落表面干燥呈粗糙粉狀,邊緣不規(guī)則。菌落排列小而緊密,與培養(yǎng)基緊密結(jié)合。根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)以及顯微鏡下的觀察結(jié)果,可以確定1號菌為放線菌屬,但由于PCR沒有結(jié)果,因此沒有進(jìn)行進(jìn)一步的菌種鑒定。

圖1 (A)1號菌菌落(B)100x油鏡下1號菌氣生菌絲及孢子絲(C)100x油鏡下1號菌基內(nèi)菌絲

2.4 針對1號菌的產(chǎn)酶條件的測定[2]

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線

2.4.2 液體培養(yǎng)基初始p H對產(chǎn)酶的影響:

圖3 液體培養(yǎng)基初始p H對產(chǎn)酶的影響

以DNS比色法對不同初始p H的液體培養(yǎng)基條件下CMC酶活進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,在p H=5.0時酶活最高,其余p H條件下酶活較低,表明p H=5.0條件下該菌產(chǎn)酶活性最旺盛。

2.4.3 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

圖4 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

以DNS比色法對不同碳源的各類液體培養(yǎng)基條件下的1號菌的CMC酶活進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,以蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基中纖維素酶酶活最高,表明蔗糖作為菌株的營養(yǎng)物質(zhì),可能對該菌產(chǎn)生纖維素酶具有較好的誘導(dǎo)作用,而CMC和濾紙作為纖維素類物質(zhì),對產(chǎn)生纖維素酶具有較好的誘導(dǎo)效果。

2.4.4 不同氮源對產(chǎn)酶的影響[3]

圖5 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

以DNS比色法對不同氮源的液體培養(yǎng)基條件下CMC酶活進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,以尿素為氮源的液體培養(yǎng)基中酶活最高。CMC酶活力反應(yīng)了纖維素酶將無定性的纖維素水解成纖維寡糖的能力,結(jié)果表明尿素作為各類培養(yǎng)基中的常用氮源,能夠較好地促進(jìn)該菌產(chǎn)生纖維素酶,檸檬酸作為一種有機(jī)酸,也能產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用,硫酸銨、草酸銨等含氮無機(jī)鹽則僅有較小的促進(jìn)作用。

3 討論與總結(jié)

關(guān)于不同配比纖維素平板培養(yǎng)基和不同水解圈比較方法的實(shí)驗(yàn)中,分析認(rèn)為:CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基1,CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基2,羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基三者相比,CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基1中菌落生長緩慢的可能原因是碳源不足,菌株的正常生長受到一定限制。CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基2加大了碳源羧甲基纖維素鈉的配比,菌株生長較快;羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基與前兩種不同的平板培養(yǎng)基相比,通過加入葡萄糖將原本培養(yǎng)基的唯一碳源纖維素改良成復(fù)合型碳源纖維素和葡萄糖,由于纖維素酶本身屬于一種誘導(dǎo)型酶,生產(chǎn)纖維素酶的菌種生長需要將單糖如葡萄糖等作為營養(yǎng)來源,之后才能夠通過纖維素誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶。同時,先培養(yǎng)后用剛果紅染色的方式使得培養(yǎng)基背景顏色降低,水解圈非常清晰易于實(shí)驗(yàn)記錄和觀察。

在進(jìn)行菌種的鑒定實(shí)驗(yàn)過程中,選擇了水解圈較大的3種菌進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。其中4號菌確定為新鞘鞍醇桿菌,5號菌確定為內(nèi)生鏈霉菌。1號菌在嘗試了多種使菌裂解釋放出DNA的方法:25m M NaOH溶液、在98℃下加熱10min進(jìn)行堿裂解;利用DNA試劑盒提取DNA,以及調(diào)整多次PCR程序設(shè)定進(jìn)行擴(kuò)增,依然沒有PCR擴(kuò)增成功。查閱文獻(xiàn)得出雖然通用引物27F和1492R,適合放線菌DNA擴(kuò)增,但是放線菌裂解非常困難,常用方法通常還需要有液氮進(jìn)行處理,要求條件較高,實(shí)驗(yàn)室無法滿足。

通過配制不同初始p H,不同碳源、不同氮源的液體培養(yǎng)基,對剛果紅染色法篩選出的1號菌進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的研究,以DNS比色法進(jìn)行CMC酶活測定,篩選的菌種最適宜的產(chǎn)酶條件為:液體培養(yǎng)基p H=5.0,以蔗糖為碳源,尿素為氮源。