王 誠 綜述，況 薇 審校

四川大學華西第二醫(yī)院病理科/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川成都 610000

宮頸癌是威脅女性生命健康最主要的惡性腫瘤，其主要致癌因素是持續(xù)性人乳頭瘤病毒(HPV)感染[1]。我國女性高危型HPV(HR-HPV)感染率為19%，與全球其他地區(qū)基本一致，感染率位于前5的HPV型別分別為16、52、58、53、18型[2]。HPV檢測是宮頸癌篩查的重要手段，國內已有一百余種HPV核酸檢測試劑盒，其均主要適用于宮頸脫落細胞標本[3]。然而，當新鮮標本無法檢測或用于回顧性流行病學研究時，需使用活檢組織標本替代。福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織是生物標本最常見的保存形式，可常年存放于病理檔案室。FFPE組織經過一定的物理和化學處理，使細胞形態(tài)、組織結構保持穩(wěn)定的同時，核酸和蛋白質亦不會受到較大的破壞，為分子病理檢測、基因分析和流行病學研究等提供了更廣泛的標本來源。但甲醛及石蠟等化學試劑可造成組織不同程度的DNA片段化及DNA、蛋白質相互交聯(lián)，對DNA提取產量和PCR擴增效率均產生不良影響[4]。目前，用于FFPE組織中的HPV檢測技術缺乏共識和規(guī)范，本文圍繞組織標本的獲取、固定和保存等方面，歸納了可能影響核酸質量的因素，并對FFPE組織的核酸提取制備及HPV檢測方法進行綜述。

1 影響核酸質量的因素

1.1組織獲取 固定前合理的組織獲取方式可更好地保證標本中核酸及蛋白質的質量。組織器官的冷缺血時間、標本大小、脫鈣方法等均影響后續(xù)FFPE組織標本的核酸分析。有研究發(fā)現(xiàn)，冷缺血時間控制在24 h內不影響PCR擴增成功率，但冷缺血時間超過24 h，其熒光原位雜交信號強度會明顯減弱[5]。另外，組織標本體積不宜過大，3～10 mm3大小的組織經固定后核酸質量保存較好，PCR擴增成功率最高。有學者研究發(fā)現(xiàn)，脫鈣方法的不同會直接影響核酸質量，乙二胺四乙酸(EDTA)和超聲脫鈣法均優(yōu)于酸性脫鈣液法，前者標本進行RT-PCR檢測可擴增出更長的片段，同時在熒光檢測方面，經甲酸脫鈣后熒光信號強度欠佳[6]。因此，根據研究者檢測需求選擇相應的組織獲取手段，以保證組織內核酸質量少受或不受影響。

1.2組織固定 固定液的pH值、固定時間和溫度都是影響FFPE組織核酸質量的決定性因素，影響PCR擴增能否成功。既往研究發(fā)現(xiàn)，中性福爾馬林固定效果較好，對核酸片段化破壞小，且固定時間在48 h內獲取的DNA完整性和產量更高，用于PCR、原位雜交和單核苷酸多態(tài)性檢測時的成功率最高；反之，延長固定時間(≥48 h)，則影響RNA相關的檢測[7]。因此，生物標本分析前組織固定程序標準化至關重要，在某些類型的腫瘤標本中，DNA和RNA的質量可能受到延遲固定或固定時間的影響。通常，福爾馬林固定時間的延長(超過18～24 h)引起RNA片段化及核酸修飾會干擾cDNA的合成，從而獲得低質量的qPCR數(shù)據。此外，對于標本固定的溫度仍有一定爭議，有研究表明，福爾馬林在4 ℃下固定可以保留FFPE組織標本中DNA的完整性，與常溫下固定的FFPE組織標本相比，前者獲得的DNA碎片化程度明顯降低[8]。

1.3組織的處理及保存 組織標本的脫水、透明和浸蠟過程也影響著核酸質量，高純度石蠟在PCR擴增中具有明顯優(yōu)勢。此外，F(xiàn)FPE組織標本的保存與核酸質量密切相關。有研究將保存了數(shù)十年的浸潤性宮頸癌FFPE組織標本用于HPV16 L1基因與人類微管蛋白-β檢測，結果發(fā)現(xiàn)，保存時間≤15年的標本均成功擴增出病毒基因和管家基因，但保存時間>15年的標本擴增出更長靶基因的能力顯著下降[9]。有研究者將保存時間為5～21年的FFPE組織標本用于提取RNA，結果發(fā)現(xiàn)保存時間對mRNA、microRNA和rRNA擴增水平并無太大影響，但其中保存時間≤1年的FFPE組織標本獲得的RNA完整性最佳[10]。所以，F(xiàn)FPE組織標本保存時間的延長會不同程度影響病毒基因和管家基因的PCR擴增。影響FFPE組織核酸質量的因素見表1。

2 核酸的提取

2.1提取步驟 一般而言，F(xiàn)FPE組織核酸提取需4個步驟：切片、脫蠟、蛋白酶消化和純化。操作前，用70%～75%乙醇擦拭切片機以減少污染；切片常采用“三明治”技術，厚度根據試劑及組織大小而定，通常推薦10 μm切片；一個刀口對應一個蠟塊；若操作中發(fā)現(xiàn)疑似污染應及時更換手套，盡可能使用一次性鑷子或牙簽轉移切片[11]。值得注意的是，由于組織表面暴露于空氣中發(fā)生的氧化反應，前2～3張切片建議丟棄，并推薦切片后1 h內進行核酸提取，或存放于4 ℃待測。脫蠟最常用的試劑為二甲苯，但其具有一定毒性，且有機溶劑的反復處理等可增加組織丟失的風險。另外，由于有機溶劑脫蠟操作比較耗時，有學者通過直接加入自配蛋白酶裂解液(蛋白酶K、EDTA、0.5%吐溫、50 mmol Tris)后，100 ℃熱處理10 min，15 000×g 4 ℃離心，同樣能獲得足量核酸，并成功擴增HPV L1基因片段[12]。現(xiàn)對于FFPE組織標本核酸提取后是否需要純化尚存有爭議，而大多研究集中應用QIAamp?DNA FFPE Tissue純化試劑盒。

2.2核酸質量的驗證 人類管家基因是用于驗證DNA質量的關鍵指標，如β-Globin或β-actin。由于福爾馬林固定等因素引起DNA碎片化會降低PCR擴增效率，因此，在FFPE組織中容易擴增小片段靶標，一般控制在65～270 bp為宜，每25 μL擴增反應體系需標本量1～10 μL。有研究發(fā)現(xiàn)，粗提試劑所獲得的基因組DNA與FFPE組織純化提取試劑相比，HPV PCR擴增結果無明顯差異[13]。因此，F(xiàn)FPE組織標本核酸提取方法的異同對HPV L1基因擴增的影響甚微。也有學者通過對比QIAamp?DNA FFPE Tissue、EX-WAXTMDNA和ReliaPrepTMFFPE gDNA 3種提取試劑盒檢測HPV16感染情況，發(fā)現(xiàn)21例頭頸部癌患者感染率分別為38.1%、33.3%、33.3%[14]。因此，QIAamp?DNA FFPE Tissue純化試劑盒可檢測出更多HPV感染病例。由于PCR擴增檢測HPV L1的靶標長度為65～700 bp，F(xiàn)FPE組織標本對于小片段病毒基因擴增更敏感，可能無法檢出大片段病毒基因亞型。FFPE組織核酸提取的主要試劑盒、方法及HPV檢測平臺見表2。

表1 影響FFPE組織核酸質量的因素

表2 核酸提取的主要試劑盒、方法及HPV檢測平臺

3 HPV檢測技術

3.1HPV特點 HPV是一種小分子雙鏈環(huán)狀DNA病毒，長度約8 000 bp，呈二十面體對稱性，無包膜，直徑為45～55 nm。其核酸按功能主要分為早期編碼區(qū)、晚期編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中晚期編碼區(qū)分為L1、L2，早期編碼區(qū)分為E1、E2、E4、E5、E6和E7，具有病毒復制、轉錄調控和細胞轉化等功能。E1、E2均與病毒復制有關，也常作為病毒整合位點。E6、E7是大多數(shù)HPV亞型的轉錄起始點，可分別與抑癌基因p53、pRb結合并導致其失活引起宮頸癌的發(fā)生。HPV有多種亞型，根據其致癌能力，分為低危型HPV(LR-HPV)和HR-HPV，LR-HPV一般與皮膚病變有關，HR-HPV與黏膜病變有關。HPV具有嚴格的宿主和組織特異性，主要感染人的皮膚或黏膜上皮細胞，初次感染HPV大部分可治愈，與病毒的侵襲能力和感染者免疫狀態(tài)相關，持續(xù)反復的HR-HPV感染可能使病毒DNA整合至宿主基因組中，破壞自身基因組和宿主染色體結構，進而導致癌基因激活，引起癌癥的發(fā)生[15]。

3.2PCR檢測技術 PCR檢測技術是HPV DNA檢測的傳統(tǒng)方法。目前，大多數(shù)商品化HPV DNA PCR檢測技術針對宮頸脫落細胞或分泌物，而組織標本的HPV DNA檢測缺乏合適的檢測方法。HPV L1基因區(qū)高度保守，并在不同亞型中的突變頻率均較低，其靶向擴增片段為65～450 bp。FFPE組織標本制備過程復雜，可能導致廣泛的DNA損傷，包括交聯(lián)和斷裂，并可能降低檢測的準確性。目前，針對L1基因區(qū)常見的通用引物分為3類，包括MY09/11、GP5+/GP6+和SPF10(INNO-LiPA)，其靶標片段大小分別為450 bp、65 bp和150 bp[16-18]。一項最新的多中心回顧性研究評估了HPV相關腫瘤的基因型分布，HPV DNA和分型檢測使用SPF-10/LiPA25系統(tǒng)，對來自50個國家或地區(qū)18 247份FFPE組織標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)在有效實施HPV疫苗接種計劃的國家或地區(qū)約90%的宮頸癌和50%的HPV相關癌癥的發(fā)生被有效預防[19]。SPF-10的擴增效率高于其他通用引物，可能是由于擴增靶區(qū)較小，擴增效率較高。同樣，有研究通過對比宮頸脫落細胞與FFPE組織標本的HPV感染情況，發(fā)現(xiàn)Onclarity熒光PCR與SPF-10檢測HPV感染的總體一致性較好(Kappa=0.82)，但對某些基因型的檢測結果存在一定差異[20]。此外，F(xiàn)FPE組織DNA提取過程中容易造成標本交叉污染，應按組織核酸提取標準操作規(guī)程進行操作，以減小污染的風險；同時，也可以設置內參以減少HPV DNA假陽性的發(fā)生。

3.3原位雜交(ISH) ISH是一種將特定標記的已知序列核酸作為探針與組織細胞中的核酸進行雜交，并對其進行檢測的方法，能顯示病毒整合到染色體上的分布情況及具體位置。熒光信號標記的核酸探針特異性識別腫瘤病灶HPV DNA/RNA，其優(yōu)勢在于成本較低，但靈敏度與特異度取決于探針的類型。當雜交信號在細胞核內為點狀密集分布時為整合狀態(tài)，點狀信號和彌散信號共存時為游離狀態(tài)與整合狀態(tài)的混合。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，ISH產生的高強度背景信號會干擾目標DNA信號，造成假陰性結果，并且DNA ISH檢測技術的靈敏度明顯低于RNA ISH檢測技術[21]。HPV E6和E7癌蛋白檢測是判斷病毒活化情況的“金標準”。近年來，采用RNAscope方法檢測FFPE組織標本中18種HR-HPV和6種LR-HPV E6/E7被證實具有較高的特異度、靈敏度及穩(wěn)定性。RNAscope使用特有探針和單分子水平檢測技術來檢測靶mRNA分子，并區(qū)分基因亞型，其獨特的“雙Z”寡核苷酸探針設計可高度特異性地在FFPE組織中檢測到每個HPV亞型轉錄的E6/E7 mRNA[22]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，HR-HPV E6/E7 mRNA ISH檢測技術在宮頸病變組織中呈不同的染色模式，可能呈現(xiàn)彌散染色核信號(CIN Ⅰ)到整個上皮多點狀細胞質及核信號(CIN Ⅲ)，此現(xiàn)象與HPV感染機制基本相符，可用于輔助宮頸病變的診斷[23]。因此，RNA ISH檢測技術能檢測出活化的HPV，并將活性病毒在腫瘤組織中的轉錄動態(tài)可視化，但缺點在于其成本較高且無法確定具體型別。

3.4其他方法 免疫組織化學p16染色是最簡單、經濟的HPV感染檢測替代標記物，應用廣泛，易于操作，高度敏感。另外，p16染色的優(yōu)勢在于標本DNA的降解對結果不會產生明顯影響，對HPV相關口咽鱗狀細胞癌的診斷特異度高達80%[24]。隨著現(xiàn)代分子診斷學方法的不斷發(fā)展，新技術逐漸被廣泛應用于FFPE組織的HPV檢測，如多重實時熒光PCR技術、多重連接依賴式探針擴增技術、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法、雜交捕獲法和測序技術等[25-27]。

4 小 結

隨著對檢測技術研究的不斷深入，HPV疫苗已成為當前研究熱點，其主要分為兩種：預防性疫苗和治療性疫苗，前者以晚期編碼區(qū)L1/L2作為靶抗原，在細胞表面完成自我組裝形成病毒樣顆粒，通過誘導機體產生特異性中和抗體及免疫反應，防止機體受到HPV感染。早期編碼區(qū)E6/E7靶抗原是HPV感染相關疾病理想的治療性疫苗，但其免疫機制復雜，仍在探索中。持續(xù)性HR-HPV感染是宮頸癌發(fā)生的先決條件，及時、準確的HPV檢測是早期診治與預防宮頸癌的關鍵。FFPE組織的HPV檢測受到多種因素的影響，包括組織的獲取、核酸的提取及檢測方法的選擇等方面。PCR技術是目前檢測病毒的有效手段之一，其限制因素較少，適合新鮮組織標本及FFPE組織標本。SPF-10 PCR體系擴增效率最佳，被廣泛應用于各類FFPE組織的檢測。RNA ISH檢測技術不僅可以定位單個細胞病毒的整合位點，還能檢測到低病毒載量的細胞，是目前FFPE組織HPV檢測的“金標準”。隨著分子診斷技術的不斷發(fā)展，HPV檢測方法逐漸呈現(xiàn)多元化，病理實驗室可根據診斷需要選擇合適的檢測方法，為臨床診療工作提供最有效的幫助。