王 誠 綜述，況 薇 審校

四川大學(xué)華西第二醫(yī)院病理科/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室，四川成都 610000

宮頸癌是威脅女性生命健康最主要的惡性腫瘤，其主要致癌因素是持續(xù)性人乳頭瘤病毒(HPV)感染[1]。我國女性高危型HPV(HR-HPV)感染率為19%，與全球其他地區(qū)基本一致，感染率位于前5的HPV型別分別為16、52、58、53、18型[2]。HPV檢測是宮頸癌篩查的重要手段，國內(nèi)已有一百余種HPV核酸檢測試劑盒，其均主要適用于宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本[3]。然而，當(dāng)新鮮標(biāo)本無法檢測或用于回顧性流行病學(xué)研究時，需使用活檢組織標(biāo)本替代。福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織是生物標(biāo)本最常見的保存形式，可常年存放于病理檔案室。FFPE組織經(jīng)過一定的物理和化學(xué)處理，使細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的同時，核酸和蛋白質(zhì)亦不會受到較大的破壞，為分子病理檢測、基因分析和流行病學(xué)研究等提供了更廣泛的標(biāo)本來源。但甲醛及石蠟等化學(xué)試劑可造成組織不同程度的DNA片段化及DNA、蛋白質(zhì)相互交聯(lián)，對DNA提取產(chǎn)量和PCR擴增效率均產(chǎn)生不良影響[4]。目前，用于FFPE組織中的HPV檢測技術(shù)缺乏共識和規(guī)范，本文圍繞組織標(biāo)本的獲取、固定和保存等方面，歸納了可能影響核酸質(zhì)量的因素，并對FFPE組織的核酸提取制備及HPV檢測方法進行綜述。

1 影響核酸質(zhì)量的因素

1.1組織獲取 固定前合理的組織獲取方式可更好地保證標(biāo)本中核酸及蛋白質(zhì)的質(zhì)量。組織器官的冷缺血時間、標(biāo)本大小、脫鈣方法等均影響后續(xù)FFPE組織標(biāo)本的核酸分析。有研究發(fā)現(xiàn)，冷缺血時間控制在24 h內(nèi)不影響PCR擴增成功率，但冷缺血時間超過24 h，其熒光原位雜交信號強度會明顯減弱[5]。另外，組織標(biāo)本體積不宜過大，3～10 mm3大小的組織經(jīng)固定后核酸質(zhì)量保存較好，PCR擴增成功率最高。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，脫鈣方法的不同會直接影響核酸質(zhì)量，乙二胺四乙酸(EDTA)和超聲脫鈣法均優(yōu)于酸性脫鈣液法，前者標(biāo)本進行RT-PCR檢測可擴增出更長的片段，同時在熒光檢測方面，經(jīng)甲酸脫鈣后熒光信號強度欠佳[6]。因此，根據(jù)研究者檢測需求選擇相應(yīng)的組織獲取手段，以保證組織內(nèi)核酸質(zhì)量少受或不受影響。

1.2組織固定 固定液的pH值、固定時間和溫度都是影響FFPE組織核酸質(zhì)量的決定性因素，影響PCR擴增能否成功。既往研究發(fā)現(xiàn)，中性福爾馬林固定效果較好，對核酸片段化破壞小，且固定時間在48 h內(nèi)獲取的DNA完整性和產(chǎn)量更高，用于PCR、原位雜交和單核苷酸多態(tài)性檢測時的成功率最高；反之，延長固定時間(≥48 h)，則影響RNA相關(guān)的檢測[7]。因此，生物標(biāo)本分析前組織固定程序標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要，在某些類型的腫瘤標(biāo)本中，DNA和RNA的質(zhì)量可能受到延遲固定或固定時間的影響。通常，福爾馬林固定時間的延長(超過18～24 h)引起RNA片段化及核酸修飾會干擾cDNA的合成，從而獲得低質(zhì)量的qPCR數(shù)據(jù)。此外，對于標(biāo)本固定的溫度仍有一定爭議，有研究表明，福爾馬林在4 ℃下固定可以保留FFPE組織標(biāo)本中DNA的完整性，與常溫下固定的FFPE組織標(biāo)本相比，前者獲得的DNA碎片化程度明顯降低[8]。

1.3組織的處理及保存 組織標(biāo)本的脫水、透明和浸蠟過程也影響著核酸質(zhì)量，高純度石蠟在PCR擴增中具有明顯優(yōu)勢。此外，F(xiàn)FPE組織標(biāo)本的保存與核酸質(zhì)量密切相關(guān)。有研究將保存了數(shù)十年的浸潤性宮頸癌FFPE組織標(biāo)本用于HPV16 L1基因與人類微管蛋白-β檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保存時間≤15年的標(biāo)本均成功擴增出病毒基因和管家基因，但保存時間>15年的標(biāo)本擴增出更長靶基因的能力顯著下降[9]。有研究者將保存時間為5～21年的FFPE組織標(biāo)本用于提取RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存時間對mRNA、microRNA和rRNA擴增水平并無太大影響，但其中保存時間≤1年的FFPE組織標(biāo)本獲得的RNA完整性最佳[10]。所以，F(xiàn)FPE組織標(biāo)本保存時間的延長會不同程度影響病毒基因和管家基因的PCR擴增。影響FFPE組織核酸質(zhì)量的因素見表1。

2 核酸的提取

2.1提取步驟 一般而言，F(xiàn)FPE組織核酸提取需4個步驟：切片、脫蠟、蛋白酶消化和純化。操作前，用70%～75%乙醇擦拭切片機以減少污染；切片常采用“三明治”技術(shù)，厚度根據(jù)試劑及組織大小而定，通常推薦10 μm切片；一個刀口對應(yīng)一個蠟塊；若操作中發(fā)現(xiàn)疑似污染應(yīng)及時更換手套，盡可能使用一次性鑷子或牙簽轉(zhuǎn)移切片[11]。值得注意的是，由于組織表面暴露于空氣中發(fā)生的氧化反應(yīng)，前2～3張切片建議丟棄，并推薦切片后1 h內(nèi)進行核酸提取，或存放于4 ℃待測。脫蠟最常用的試劑為二甲苯，但其具有一定毒性，且有機溶劑的反復(fù)處理等可增加組織丟失的風(fēng)險。另外，由于有機溶劑脫蠟操作比較耗時，有學(xué)者通過直接加入自配蛋白酶裂解液(蛋白酶K、EDTA、0.5%吐溫、50 mmol Tris)后，100 ℃熱處理10 min，15 000×g 4 ℃離心，同樣能獲得足量核酸，并成功擴增HPV L1基因片段[12]?，F(xiàn)對于FFPE組織標(biāo)本核酸提取后是否需要純化尚存有爭議，而大多研究集中應(yīng)用QIAamp?DNA FFPE Tissue純化試劑盒。

2.2核酸質(zhì)量的驗證 人類管家基因是用于驗證DNA質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，如β-Globin或β-actin。由于福爾馬林固定等因素引起DNA碎片化會降低PCR擴增效率，因此，在FFPE組織中容易擴增小片段靶標(biāo)，一般控制在65～270 bp為宜，每25 μL擴增反應(yīng)體系需標(biāo)本量1～10 μL。有研究發(fā)現(xiàn)，粗提試劑所獲得的基因組DNA與FFPE組織純化提取試劑相比，HPV PCR擴增結(jié)果無明顯差異[13]。因此，F(xiàn)FPE組織標(biāo)本核酸提取方法的異同對HPV L1基因擴增的影響甚微。也有學(xué)者通過對比QIAamp?DNA FFPE Tissue、EX-WAXTMDNA和ReliaPrepTMFFPE gDNA 3種提取試劑盒檢測HPV16感染情況，發(fā)現(xiàn)21例頭頸部癌患者感染率分別為38.1%、33.3%、33.3%[14]。因此，QIAamp?DNA FFPE Tissue純化試劑盒可檢測出更多HPV感染病例。由于PCR擴增檢測HPV L1的靶標(biāo)長度為65～700 bp，F(xiàn)FPE組織標(biāo)本對于小片段病毒基因擴增更敏感，可能無法檢出大片段病毒基因亞型。FFPE組織核酸提取的主要試劑盒、方法及HPV檢測平臺見表2。

表1 影響FFPE組織核酸質(zhì)量的因素

表2 核酸提取的主要試劑盒、方法及HPV檢測平臺

3 HPV檢測技術(shù)

3.1HPV特點 HPV是一種小分子雙鏈環(huán)狀DNA病毒，長度約8 000 bp，呈二十面體對稱性，無包膜，直徑為45～55 nm。其核酸按功能主要分為早期編碼區(qū)、晚期編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中晚期編碼區(qū)分為L1、L2，早期編碼區(qū)分為E1、E2、E4、E5、E6和E7，具有病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等功能。E1、E2均與病毒復(fù)制有關(guān)，也常作為病毒整合位點。E6、E7是大多數(shù)HPV亞型的轉(zhuǎn)錄起始點，可分別與抑癌基因p53、pRb結(jié)合并導(dǎo)致其失活引起宮頸癌的發(fā)生。HPV有多種亞型，根據(jù)其致癌能力，分為低危型HPV(LR-HPV)和HR-HPV，LR-HPV一般與皮膚病變有關(guān)，HR-HPV與黏膜病變有關(guān)。HPV具有嚴(yán)格的宿主和組織特異性，主要感染人的皮膚或黏膜上皮細(xì)胞，初次感染HPV大部分可治愈，與病毒的侵襲能力和感染者免疫狀態(tài)相關(guān)，持續(xù)反復(fù)的HR-HPV感染可能使病毒DNA整合至宿主基因組中，破壞自身基因組和宿主染色體結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致癌基因激活，引起癌癥的發(fā)生[15]。

3.2PCR檢測技術(shù) PCR檢測技術(shù)是HPV DNA檢測的傳統(tǒng)方法。目前，大多數(shù)商品化HPV DNA PCR檢測技術(shù)針對宮頸脫落細(xì)胞或分泌物，而組織標(biāo)本的HPV DNA檢測缺乏合適的檢測方法。HPV L1基因區(qū)高度保守，并在不同亞型中的突變頻率均較低，其靶向擴增片段為65～450 bp。FFPE組織標(biāo)本制備過程復(fù)雜，可能導(dǎo)致廣泛的DNA損傷，包括交聯(lián)和斷裂，并可能降低檢測的準(zhǔn)確性。目前，針對L1基因區(qū)常見的通用引物分為3類，包括MY09/11、GP5+/GP6+和SPF10(INNO-LiPA)，其靶標(biāo)片段大小分別為450 bp、65 bp和150 bp[16-18]。一項最新的多中心回顧性研究評估了HPV相關(guān)腫瘤的基因型分布，HPV DNA和分型檢測使用SPF-10/LiPA25系統(tǒng)，對來自50個國家或地區(qū)18 247份FFPE組織標(biāo)本進行檢測，發(fā)現(xiàn)在有效實施HPV疫苗接種計劃的國家或地區(qū)約90%的宮頸癌和50%的HPV相關(guān)癌癥的發(fā)生被有效預(yù)防[19]。SPF-10的擴增效率高于其他通用引物，可能是由于擴增靶區(qū)較小，擴增效率較高。同樣，有研究通過對比宮頸脫落細(xì)胞與FFPE組織標(biāo)本的HPV感染情況，發(fā)現(xiàn)Onclarity熒光PCR與SPF-10檢測HPV感染的總體一致性較好(Kappa=0.82)，但對某些基因型的檢測結(jié)果存在一定差異[20]。此外，F(xiàn)FPE組織DNA提取過程中容易造成標(biāo)本交叉污染，應(yīng)按組織核酸提取標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行操作，以減小污染的風(fēng)險；同時，也可以設(shè)置內(nèi)參以減少HPV DNA假陽性的發(fā)生。

3.3原位雜交(ISH) ISH是一種將特定標(biāo)記的已知序列核酸作為探針與組織細(xì)胞中的核酸進行雜交，并對其進行檢測的方法，能顯示病毒整合到染色體上的分布情況及具體位置。熒光信號標(biāo)記的核酸探針特異性識別腫瘤病灶HPV DNA/RNA，其優(yōu)勢在于成本較低，但靈敏度與特異度取決于探針的類型。當(dāng)雜交信號在細(xì)胞核內(nèi)為點狀密集分布時為整合狀態(tài)，點狀信號和彌散信號共存時為游離狀態(tài)與整合狀態(tài)的混合。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，ISH產(chǎn)生的高強度背景信號會干擾目標(biāo)DNA信號，造成假陰性結(jié)果，并且DNA ISH檢測技術(shù)的靈敏度明顯低于RNA ISH檢測技術(shù)[21]。HPV E6和E7癌蛋白檢測是判斷病毒活化情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近年來，采用RNAscope方法檢測FFPE組織標(biāo)本中18種HR-HPV和6種LR-HPV E6/E7被證實具有較高的特異度、靈敏度及穩(wěn)定性。RNAscope使用特有探針和單分子水平檢測技術(shù)來檢測靶mRNA分子，并區(qū)分基因亞型，其獨特的“雙Z”寡核苷酸探針設(shè)計可高度特異性地在FFPE組織中檢測到每個HPV亞型轉(zhuǎn)錄的E6/E7 mRNA[22]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HR-HPV E6/E7 mRNA ISH檢測技術(shù)在宮頸病變組織中呈不同的染色模式，可能呈現(xiàn)彌散染色核信號(CIN Ⅰ)到整個上皮多點狀細(xì)胞質(zhì)及核信號(CIN Ⅲ)，此現(xiàn)象與HPV感染機制基本相符，可用于輔助宮頸病變的診斷[23]。因此，RNA ISH檢測技術(shù)能檢測出活化的HPV，并將活性病毒在腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄動態(tài)可視化，但缺點在于其成本較高且無法確定具體型別。

3.4其他方法 免疫組織化學(xué)p16染色是最簡單、經(jīng)濟的HPV感染檢測替代標(biāo)記物，應(yīng)用廣泛，易于操作，高度敏感。另外，p16染色的優(yōu)勢在于標(biāo)本DNA的降解對結(jié)果不會產(chǎn)生明顯影響，對HPV相關(guān)口咽鱗狀細(xì)胞癌的診斷特異度高達80%[24]。隨著現(xiàn)代分子診斷學(xué)方法的不斷發(fā)展，新技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用于FFPE組織的HPV檢測，如多重實時熒光PCR技術(shù)、多重連接依賴式探針擴增技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法、雜交捕獲法和測序技術(shù)等[25-27]。

4 小 結(jié)

隨著對檢測技術(shù)研究的不斷深入，HPV疫苗已成為當(dāng)前研究熱點，其主要分為兩種：預(yù)防性疫苗和治療性疫苗，前者以晚期編碼區(qū)L1/L2作為靶抗原，在細(xì)胞表面完成自我組裝形成病毒樣顆粒，通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性中和抗體及免疫反應(yīng)，防止機體受到HPV感染。早期編碼區(qū)E6/E7靶抗原是HPV感染相關(guān)疾病理想的治療性疫苗，但其免疫機制復(fù)雜，仍在探索中。持續(xù)性HR-HPV感染是宮頸癌發(fā)生的先決條件，及時、準(zhǔn)確的HPV檢測是早期診治與預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。FFPE組織的HPV檢測受到多種因素的影響，包括組織的獲取、核酸的提取及檢測方法的選擇等方面。PCR技術(shù)是目前檢測病毒的有效手段之一，其限制因素較少，適合新鮮組織標(biāo)本及FFPE組織標(biāo)本。SPF-10 PCR體系擴增效率最佳，被廣泛應(yīng)用于各類FFPE組織的檢測。RNA ISH檢測技術(shù)不僅可以定位單個細(xì)胞病毒的整合位點，還能檢測到低病毒載量的細(xì)胞，是目前FFPE組織HPV檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，HPV檢測方法逐漸呈現(xiàn)多元化，病理實驗室可根據(jù)診斷需要選擇合適的檢測方法，為臨床診療工作提供最有效的幫助。