李　慕

白茶對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)抗氧化損傷和抗衰老作用研究

李慕

（邵陽(yáng)學(xué)院湖南邵陽(yáng)422000）

文章選取秀麗隱桿線蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎冒缀零y針（Baihaoyinzhen, YZ）、白牡丹（Baimudan, MD）和壽眉（Shoumei, SM）來(lái)比較不同原料來(lái)源白茶的體內(nèi)抗氧化和抗衰老作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種白茶在百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激秀麗隱桿線蟲(chóng)模型中，均表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗衰老作用。在壽命和體內(nèi)抗氧化酶含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，3種類(lèi)型的白茶測(cè)試的濃度中均以1 000 mg/L的濃度效果最佳，并且在該濃度下，白毫銀針的抗氧化作用明顯強(qiáng)于白牡丹和壽眉，而白牡丹與壽眉無(wú)明顯差異。在分子水平上，白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴(lài)于經(jīng)典的Insulin/IGF-1信號(hào)途徑。

白茶；百草枯；抗氧化損傷；抗衰老

如何延長(zhǎng)生物壽命、延緩衰老，一直是科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。衰老是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，由于科研工作者觀察角度、研究方法的不同，關(guān)于衰老機(jī)制的學(xué)說(shuō)也不盡相同。其中衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)可度較高，其認(rèn)為氧氣進(jìn)入生物體后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚匝踝杂苫?，過(guò)量的自由基會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化損傷的累積，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老[1]。而生物體內(nèi)所含的抗氧化酶體系及外部攝入飲食中所含的抗氧化活性物質(zhì)能夠通過(guò)終止自由基反應(yīng)，減少自由基的產(chǎn)生并增長(zhǎng)個(gè)體的壽命[2-3]。秀麗隱桿線蟲(chóng)的生命周期短，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易于操作，且具備完備的發(fā)育和解剖學(xué)特征及復(fù)雜的遺傳學(xué)特征。其抗氧化及抗衰老相關(guān)基因與人類(lèi)高度同源，使其成為在衰老研究領(lǐng)域中國(guó)際公認(rèn)首選的模式生物。

白茶是我國(guó)傳統(tǒng)的六大茶類(lèi)之一，有研究證明，白茶具有良好的抗突變、抗癌、抗氧化效果，并且在神經(jīng)保護(hù)、預(yù)防糖尿病及生殖健康等方面有諸多效果[4]。但有關(guān)白茶的抗氧化損傷研究多數(shù)是體外實(shí)驗(yàn)[5]，體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)較為缺乏。利用秀麗隱桿線蟲(chóng)作為模式生物，體內(nèi)研究白茶的抗氧化損傷、抗衰老功能以及分子機(jī)制少有報(bào)道。因采摘和制作工藝的不同，造成不同種類(lèi)白茶含有的化學(xué)活性物質(zhì)存在較大的差異，其抗氧化和抗衰老效果也可能會(huì)有所不同。本研究選取3種代表性白茶（白毫銀針、白牡丹和壽眉）為研究對(duì)象，以秀麗隱桿線蟲(chóng)為動(dòng)物模型，旨在探討不同白茶提取物的抗氧化和抗衰老效果的差異和分子機(jī)制，為白茶促進(jìn)人體健康，延緩人體衰老的保健功效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選取白茶為2018年白毫銀針（Baihaoyinzhen, YZ）、2018年白牡丹（Baimudan, MD）、2018年壽眉（Shoumei, SM），制于福建福鼎。

白茶提取物制備過(guò)程：取200 g白茶葉進(jìn)行粉碎，過(guò)200目篩，獲得白茶干粉；白茶干粉加入2 500 mL 50 ℃～60 ℃的純凈水中，攪拌均勻，加入植物水解酶，在超聲波輔助下酶解4 h～6 h，滅酶，經(jīng)過(guò)高速離心取上清液，即得提取液；通過(guò)超濾膜對(duì)提取液進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)于不同提取物選擇相應(yīng)溫度進(jìn)行真空濃縮，并干燥、儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為秀麗隱桿線蟲(chóng)N2品系、GA186突變型品系。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)

秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)分為非氧化應(yīng)激組和氧化應(yīng)激組兩大組（各3個(gè)平行），每個(gè)大組里又分3個(gè)白茶提取液處理組（處理濃度分別為100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L）以及1個(gè)空白對(duì)照組（0 mg/L）。將野生型（N2品系）同步化的秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度的3種白茶提取液培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至L2時(shí)期后，非氧化應(yīng)激組不做氧化應(yīng)激處理，氧化應(yīng)激組使用2 mM百草枯進(jìn)行氧化應(yīng)激處理。各組的每個(gè)培養(yǎng)皿上20條～25條成蟲(chóng)，定期轉(zhuǎn)板，非氧化應(yīng)激組24 h記錄一次線蟲(chóng)死亡數(shù)目，百草枯氧化應(yīng)激組12 h記錄一次，在進(jìn)行壽命統(tǒng)計(jì)時(shí)，以線蟲(chóng)L2時(shí)期為記錄起始時(shí)間。

1.2.2 氧化應(yīng)激組脂褐素分析實(shí)驗(yàn)

選取存活率為20％的線蟲(chóng)，NaN3麻醉后制片，在倒置熒光顯微鏡（參數(shù)為激發(fā)340 nm～380 nm，發(fā)射430 nm）下拍攝線蟲(chóng)脂褐素?zé)晒鈭D片，使用ImageJ軟件分析脂褐素?zé)晒馑剑⒗L圖。

1.2.3 氧化應(yīng)激組秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶含量分析

各組線蟲(chóng)處理培養(yǎng)5 d后進(jìn)行收集，平均分配后，每管大約500條成蟲(chóng)，進(jìn)行洗滌超聲破碎離心取上清液，根據(jù)SOD測(cè)定試劑盒的操作步驟來(lái)測(cè)定相關(guān)抗氧化酶含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；組間均值比較采用單因素方差分析，*表示＜0.05，差異顯著，**表示＜0.01，差異極顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響

在非氧化應(yīng)激組中，不同種類(lèi)白茶提取液各濃度處理后線蟲(chóng)的平均壽命如表1所示。3種白茶的3種濃度提取液處理組與空白對(duì)照組對(duì)比，平均壽命經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明在非急性氧化應(yīng)激狀態(tài)下，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度范圍內(nèi)，白茶提取液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命沒(méi)有顯著性影響。

在百草枯處理的氧化應(yīng)激組中，不同種類(lèi)白茶提取液各濃度處理后線蟲(chóng)的平均壽命如表2所示。白茶的3種濃度提取液處理組線蟲(chóng)的平均壽命相比空白對(duì)照組有顯著的延長(zhǎng)，其中白毫銀針組效果最為顯著，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L濃度下分別延長(zhǎng)了19.3％、24.8％和31.8％。壽眉組與白牡丹組相比，線蟲(chóng)的平均壽命沒(méi)有顯著性差異，延長(zhǎng)壽命效果略差于白毫銀針組。實(shí)驗(yàn)表明，在百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激組中，不同種類(lèi)白茶提取液均對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)有保護(hù)作用，能夠提高秀麗隱桿線蟲(chóng)氧化應(yīng)激抵抗力，并且在測(cè)試的不同濃度中，1 000 mg/L濃度的效果最好。

表1不同濃度白茶處理后線蟲(chóng)（非氧化應(yīng)激組）的平均壽命統(tǒng)計(jì)（單位：d）

白茶類(lèi)型提取液濃度/mg/L01005001 000 YZ20.09±1.1220.31±1.2320.46±1.0520.39±0.95 SM20.09±1.1220.01±1.1520.20±1.0520.30±1.22 MD20.09±1.1218.98±1.0320.23±1.2120.33±1.02

表2不同濃度白茶處理后線蟲(chóng)（氧化應(yīng)激組）的平均壽命統(tǒng)計(jì)（單位：d）

白茶類(lèi)型提取液濃度/mg/L01005001 000 YZ3.11±0.853.71±0.95*3.88±0.98*4.10±0.90** SM3.11±0.853.41±1.10*3.52±1.15*3.67±1.08* MD3.11±0.853.39±1.03*3.49±1.13*3.63±1.02*

注：*代表與空白對(duì)照組相比，＜0.05；**代表與空白對(duì)照組相比，＜0.01。

2.2 白茶提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)脂褐素的影響

圖1　3種白茶提取物對(duì)野生型（N2）秀麗隱桿線蟲(chóng)脂褐素的影響比較（氧化應(yīng)激組）

大部分生物在衰老的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體自噬后，未被消化的化合物和一些脂質(zhì)會(huì)聚集在一起形成脂褐素，這種現(xiàn)象在秀麗隱桿線蟲(chóng)中也存在。脂褐素可以自發(fā)熒光，可以通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。生物越是衰老，脂褐素濃度越高，可以觀察到的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，因此脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度可以作為評(píng)價(jià)線蟲(chóng)衰老程度的重要指標(biāo)[6]。

百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激組中，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L的處理濃度下，白毫銀針組的脂褐素含量對(duì)比空白對(duì)照組分別下降了10.2％、14.1％和21.3％，壽眉組的脂褐素含量對(duì)比空白對(duì)照組分別下降了7.3％、10.2％和16.8％，白牡丹組的脂褐素含量對(duì)比空白對(duì)照組分別下降了6.9％、9.4％和15.7％。如圖1所示，3種白茶提取液的3個(gè)濃度處理下的脂褐素積累相比空白對(duì)照組均有下降，其中白毫銀針組效果最為顯著，壽眉組與白牡丹組沒(méi)有顯著差異。由此可知，脂褐素積累的下降趨勢(shì)和壽命延長(zhǎng)的趨勢(shì)基本吻合。

2.3 白茶提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶含量的影響

細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基、MDA、自由基和脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，引起細(xì)胞衰老，而抗氧化酶（SOD）可以抑制這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用，因此，通過(guò)測(cè)定其活性可以評(píng)估生物的抗氧化損傷能力。鑒于在1 000 mg/L的濃度下，3種白茶提取液在對(duì)氧化應(yīng)激組線蟲(chóng)延長(zhǎng)壽命和抑制脂褐素積累上效果最佳，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象為氧化應(yīng)激處理后的N2品系秀麗隱桿線蟲(chóng)，3種白茶提取液濃度為1 000 mg/L，空白對(duì)照組濃度為0 mg/L。結(jié)果顯示，在急性氧化應(yīng)激條件下，與空白對(duì)照組相比，白毫銀針組、壽眉組和白牡丹組線蟲(chóng)體內(nèi)SOD含量分別提高了61.1％、40.6％和35.3％（見(jiàn)圖2），說(shuō)明白茶提取物可以提高線蟲(chóng)體內(nèi)SOD的含量，增強(qiáng)其抗氧化損傷的能力。同時(shí)，白毫銀針組提升效果高于壽眉組和白牡丹組，與前期壽命實(shí)驗(yàn)和脂褐素實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)相吻合，也進(jìn)一步證實(shí)了線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性、脂褐素積累情況與壽命之間存在高度相關(guān)性。

圖2　白茶提取物對(duì)野生型（N2）線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶含量的影響（氧化應(yīng)激組）

2.4 白茶提取物對(duì)GA186品系秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響

圖3　白茶提取物對(duì)GA186品系秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響

影響線蟲(chóng)壽命的最主要分子機(jī)制為Insulin/IGF-1信號(hào)途徑，其關(guān)鍵性基因有。為了分析白茶提取物對(duì)處于急性氧化應(yīng)激條件下的線蟲(chóng)的保護(hù)作用的分子機(jī)制是否與該經(jīng)典途徑相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選擇GA186（基因型為sod-3(tm760)X）突變型線蟲(chóng)進(jìn)行氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，用濃度為1 000 mg/L的3種白茶提取液進(jìn)行處理，測(cè)定其壽命。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，空白對(duì)照組（0 mg/L）的平均壽命為2.88 d，白毫銀針、壽眉和白牡丹實(shí)驗(yàn)組的平均壽命分別為2.77 d、2.83 d、2.70 d（見(jiàn)圖3）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組線蟲(chóng)平均壽命無(wú)顯著差異，說(shuō)明白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴(lài)于經(jīng)典的Insulin/IGF-1信號(hào)途徑。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，3種白茶提取物在急性氧化應(yīng)激秀麗隱桿線蟲(chóng)模型中，表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗衰老作用。3種類(lèi)型的白茶提取液的測(cè)試濃度中，均以1 000 mg/L濃度的效果最佳，其中在相同提取液濃度條件下，白毫銀針的抗氧化作用明顯強(qiáng)于白牡丹和壽眉，而白牡丹與壽眉無(wú)明顯差異。白茶提取物的主要成分為茶多酚、黃酮、咖啡因等物質(zhì)，但是不能排除有極微量的小分子活性物質(zhì)也在里面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，所以本實(shí)驗(yàn)中并未對(duì)3種白茶提取物的主要化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定分析。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，3種白茶的提取物中，白毫銀針的茶多酚、總黃酮含量要高于壽眉和白牡丹，壽眉和白牡丹的相關(guān)成分含量差別不大，而茶多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)體外和體內(nèi)抗氧化能力顯著[7]，這從側(cè)面揭示了白毫銀針抗氧化、抗衰老作用明顯強(qiáng)于白牡丹和壽眉的原因，但是也不能排除在不同類(lèi)型白茶提取物中可能存在其他微量的活性物質(zhì)在發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

在生化水平上，3種白茶提取物均能提高線蟲(chóng)體內(nèi)SOD的含量，增強(qiáng)其抗氧化損傷的能力，延緩線蟲(chóng)衰老。而在分子水平上，白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴(lài)于經(jīng)典的Insulin/IGF-1信號(hào)途徑。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.07.07

TS272.5

A

2095-1205(2022)07-20-03

湖南省教育廳一般項(xiàng)目“三種白茶的體內(nèi)抗氧化損傷效果與機(jī)制研究”（18C0812）