沈思思

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

仔豬腹瀉是仔豬常見(jiàn)疾病，病因復(fù)雜，可由細(xì)菌病和病毒病引起[1]。細(xì)菌病主要包括大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等；病毒病主要包括豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）和豬輪狀病毒（Porcine rotavirus, PoRV）等。這些疾病臨床癥狀相似，需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診[2]。

近期齊齊哈爾市某豬場(chǎng)送檢3只病死仔豬。該豬場(chǎng)存欄量為850頭，此前免疫過(guò)豬瘟疫苗、豬呼吸與繁殖障礙疫苗、豬偽狂犬疫苗和豬細(xì)小病毒疫苗。此次仔豬腹瀉發(fā)病豬為5～9日齡，臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振、食欲減退、迅速消瘦、排黃綠色稀便并伴有嘔吐現(xiàn)象。該疾病在豬場(chǎng)迅速蔓延，仔豬發(fā)病率為95 %，死亡率達(dá)到30 %。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病理剖檢及病料采集 對(duì)3只病死仔豬進(jìn)行剖檢并采集20份發(fā)病仔豬肛拭子。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA、RNA試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA MarkerⅡ、Taq酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；離心機(jī)（TGL-16G）購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；PCR儀（S1000）購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；凝膠成像儀（WD-9413B）購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)在腸道壁少量蘸取，在麥康凱培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃ 培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2 鏡檢 將長(zhǎng)出的單個(gè)菌落進(jìn)行劃線傳代，37 ℃ 培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。將傳代后的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 DNA提取 將鏡檢過(guò)的同一單個(gè)菌落用DNA試劑盒提取DNA。

1.2.4 黏附素毒力基因檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]，合成相關(guān)的毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，毒力基因引物序列如表1。

1.2.5 病毒性診斷方法 （1）病料處理及RNA提?。簩⒉杉?0份肛拭子用PDS處理后，4 000 r離心5 min取上清。將上清液用RNA提取試劑盒提取RNA。（2）cDNA合成及PCR擴(kuò)增：用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]，用PEDV、TGEV、PDCoV和GARV引物分別對(duì)20份備檢樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表2。反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μl，2×Taq PCR Master Mix12.5 μl，上、下游引物1.0 μl，ddH2O 8.5 μl，總體積25 μl。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s、55 ℃ 30s，72 ℃ 40s，循環(huán)30次，72 ℃ 10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在1 % 瓊脂糖凝膠板上點(diǎn)樣，電泳15 min，凝膠成像儀上觀察結(jié)果。送生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI指導(dǎo)進(jìn)行，將細(xì)菌培養(yǎng)到1.5× 108CFU/ml，用接種環(huán)均勻劃線在培養(yǎng)基上，將藥敏片按順序放置在平板上，37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

3只病死仔豬剖檢均表現(xiàn)為腸壁薄而透明，腸腔內(nèi)積聚黃色液體和氣體，腸壁有出血并伴有水腫現(xiàn)象，胃里有未消化的凝乳塊，見(jiàn)圖1。

圖1 仔豬剖檢

2.2 細(xì)菌學(xué)診斷結(jié)果

麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出粉紅色小菌落，純化后，顯微鏡下觀察看到革蘭氏陰性短小桿菌，散在分布，可以確定為大腸桿菌，見(jiàn)圖2。毒力基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌是K99毒力基因，為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）。20份樣本中檢出15份大腸桿菌陽(yáng)性，見(jiàn)圖3。

圖2 大腸桿菌鏡檢圖

圖3 大腸桿菌K99 PCR擴(kuò)增圖

2.3 病毒學(xué)診斷結(jié)果

PCR結(jié)果見(jiàn)圖4，20份樣本中只檢出PEDV陽(yáng)性樣本12份。TGEV、PDCoV和PoRV均為陰性。PEDV與Bank登錄序列AF353511同源性為99 %。

圖4 PEDV PCR擴(kuò)增圖

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示該株細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星和丁胺卡那敏感，對(duì)林可霉素、氨芐西林、頭孢唑林、土霉素、慶大霉素、四環(huán)素和青霉素耐藥。

3 討論

PEDV造成的仔豬腹瀉與TGEV、PDCoV和PoRV臨床癥狀和病理剖檢相似，如需確認(rèn)需結(jié)合PCR檢測(cè)。PEDV會(huì)造成機(jī)體免疫力下降，從而易感染大腸桿菌。大腸桿菌是腸道正常菌群之一，但是在特定條件下可以致病，本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)和染色鏡檢診斷為大腸桿菌，結(jié)合毒力基因檢測(cè)確定其為K99產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，對(duì)機(jī)體有致病性。該豬場(chǎng)是PEDV和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的混合感染，導(dǎo)致仔豬大量死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV應(yīng)以預(yù)防為主，按時(shí)接種疫苗。為防止進(jìn)一步的疾病擴(kuò)散，應(yīng)對(duì)豬舍進(jìn)行徹底的清潔消毒，PEDV和大腸桿菌一般會(huì)隨著豬的排泄物排出，污染飼料和水源等，還會(huì)通過(guò)氣溶膠傳播，所以應(yīng)將污染物及時(shí)焚毀，并將患病豬進(jìn)行隔離，控制好傳染源，是阻止疾病傳播的第一步。仔豬腹瀉易發(fā)生在寒冷季節(jié)，因此也要做好豬舍的保暖工作。

4 結(jié)論

該豬場(chǎng)病毒與細(xì)菌的PCR檢測(cè)結(jié)果表明該豬場(chǎng)由PEDV和致病性K99產(chǎn)腸毒素大腸桿菌混合感染所致。20份肛拭子檢測(cè)結(jié)果為PEDV樣本總陽(yáng)性率為12/20，大腸桿菌樣本總陽(yáng)性率為15/20，其中PEDV與大腸桿菌混合感染陽(yáng)性率為12/15，TGEV、PDCoV和PoRV未檢出。藥敏結(jié)果顯示該菌株對(duì)環(huán)丙沙星和丁胺卡那敏感。經(jīng)環(huán)丙沙星治療，病情得到初步控制。