楊雪佳，馬義麗，李玉杰，吳登強(qiáng)，周素芳

（1.國家生物靶向診治國際聯(lián)合研究中心，廣西生物靶向診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西腫瘤靶向診治協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西生物靶向診治研究人才小高地，廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 南寧 530021）

關(guān)鍵字：肝細(xì)胞癌；數(shù)據(jù)挖掘；TTK

0 引言

肝癌是癌癥相關(guān)第四大死亡原因，也是最難治療的癌癥之一，每年導(dǎo)致近百萬人死亡。HCC占原發(fā)性肝癌的 80%-90%[1]，死亡率位居全球第三[2]。2022年在中國診斷出的前五種癌癥類型中肝癌排第四，癌癥死亡的前五位原因肝癌排第二[3]。肝癌具有發(fā)病隱匿、預(yù)后很差、惡性程度高等生物學(xué)特征[4]。因此進(jìn)一步加深對HCC發(fā)病機(jī)制的研究十分重要。深入探討肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后的生物標(biāo)志物對肝細(xì)胞癌的研究有著重要意義。紡錘體組裝檢查點(diǎn)激酶 TTK ( Mps1 ) 基因（NM_003318）位于染色體6q13-q21上，編碼雙絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶[5]。TTK是紡錘體組裝檢查點(diǎn)的核心組成部分，其作用是確保染色體正確分布到子細(xì)胞[6]。除了睪丸和胎盤，通過Northern 印跡在正常組織中幾乎無法檢測到TTK。然而，TTK的高表達(dá)水平可以在不同類型的癌癥中檢測到，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、食道癌和乳腺癌。TTK在肝癌中表達(dá)明顯增高。此外，TTK在肝癌具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用[7]。這些結(jié)果提示TTK可能作為診斷肝癌的潛在預(yù)測指標(biāo)。

1 資料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載關(guān)于肝細(xì)胞癌的TCGA-LIHC轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（FPKM格式）和樣本臨床信息，包含374個(gè)HCC和50個(gè)正常組織。將FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成了TPM格式并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后用于基因表達(dá)分析。基因表達(dá)分析采用wilcoxon秩和檢驗(yàn)，臨床特征分析Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，癌和癌旁配對樣本差異分析采用配對樣本T檢驗(yàn)。生存分析Kaplan-Meier生存分析與log-rank檢驗(yàn)，采用Survival R包完成，ROC分析采用PROC R包。使用ggplot R包進(jìn)行可視化。

1.2 臨床樣本

從廣西醫(yī)科大學(xué)獲得10對匹配的HCC組織和鄰近癌旁組織。以上樣本采集時(shí)間為2020年1月至2021年8月。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):20200035)。所有人體組織標(biāo)本的處理都嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》中的道德準(zhǔn)則。所有患者均提供知情同意。上述臨床標(biāo)本的RNA純化、鑒定及RNA序列均由中國Novelbio公司完成。采用R包“Limma”中的Wilcoxon檢驗(yàn)驗(yàn)證TTK的表達(dá)。癌和癌旁配對樣本差異分析采用配對樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TTK在TCGA肝細(xì)胞癌組織和正常組織中表達(dá)情況

由圖1A可知，TTK在TCGA 數(shù)據(jù)庫HCC組織表達(dá)顯著高于正常組織（P＜0.001）。圖1B在50對配對樣本組中，除了一組癌組織TTK表達(dá)低于正常組織外，大部分組均高于正常組織（P＜0.001）。說明轉(zhuǎn)錄水平上TTK在HCC組織中高表達(dá)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中TTK轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況

2.2 TTK表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

由圖2A-2B可知，TTK表達(dá)在HCC病理分期StageⅠ-Ⅲ和組織分級(jí)G1-G4中其表達(dá)逐漸升高，StageⅡ和StageⅢ與StageⅠ相比，TTK表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。然而StageⅣ與各分期無顯著差異，考慮StageⅣ僅有5個(gè)樣本，樣本數(shù)過少不具有代表性。G3和G4與G1相比，TTK表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。反映HCC疾病惡化程度越嚴(yán)重，TTK表達(dá)越高。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中TTK表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.3 TTK表達(dá)與患者生存狀態(tài)關(guān)系

由圖3A-B可知，HCC患者在總體生存和無進(jìn)展生存方面，TTK高表達(dá)組比低表達(dá)組隨著隨訪時(shí)間延長，病人生存率逐漸下降。說明TTK高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中TTK表達(dá)與患者生存狀態(tài)關(guān)系

2.4 ROC分析TTK診斷效能

由圖4A可知，在預(yù)測正常和HCC結(jié)局上，TTK的預(yù)測能力有較高準(zhǔn)確性（AUC=0.971，CI=0.955-0.987）；圖4B可知，在預(yù)測病理早期（StageⅠ-Ⅱ）和晚期（StageⅢ-Ⅳ）病理狀態(tài)上，TTK的預(yù)測能力有較低準(zhǔn)確性（AUC=O.601,CI=0.530-0.672）; 圖4C可知，在預(yù)測組織分級(jí)早期（G1-G2）和晚期（G3-G4）方面，TTK預(yù)測效能有一定準(zhǔn)確性（AUC=0.680,CI=0.625-0.735）。可推斷，TTK用作為診斷HCC良好指標(biāo)。

圖4 ROC分析TTK診斷效能

2.5 臨床樣本驗(yàn)證TTK在HCC中表達(dá)

通過收集來自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的十對HCC和配對癌旁樣本，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序挖掘TTK基因在癌和正常組織差異表達(dá)。有圖5A可知，TTK在HCC組織中高表達(dá)（P＜0.05）。圖5B可知，在十組配對樣本中，癌組織TTK表達(dá)量均高于正常組織（P＜0.05）。

圖5 臨床樣本驗(yàn)證TTK轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況

3 結(jié)論

肝細(xì)胞癌（HCC）是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，并且在全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷上升[8]。HCC的發(fā)病率、頻繁復(fù)發(fā)、高死亡率和目前治療方案的局限性，使HCC被公認(rèn)為主要的公共衛(wèi)生問題。HCC是一種生物學(xué)復(fù)雜且高度異質(zhì)的疾病[9]。常規(guī)的臨床和病理學(xué)指標(biāo)可用于判斷肝細(xì)胞癌分期和預(yù)后，但準(zhǔn)確性有限。肝細(xì)胞癌變的分子機(jī)制仍不清楚[10]。TTK該基因編碼一種參與細(xì)胞有絲分裂和增殖的雙特異性蛋白激酶。目前有研究報(bào)道，TTK高表達(dá)與多種腫瘤預(yù)后不良相關(guān)，包括三陰性乳腺癌[11]、胃癌[12]、前列腺癌[13]和膀胱癌[14]，但其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況和預(yù)后相關(guān)性報(bào)道較少見。Miao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TTK在肝臟腫瘤組織中表達(dá)水平較肝臟組織高,間接表明TTK可作為肝細(xì)胞癌的一個(gè)潛在癌基因。因此進(jìn)一步探討TTK在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況和臨床特征相關(guān)性十分必要。TCGA數(shù)據(jù)庫是目前被廣泛使用的腫瘤學(xué)數(shù)據(jù)庫，并得到了廣泛科研工作者的認(rèn)同。本實(shí)驗(yàn)通過對TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)深入挖掘，發(fā)現(xiàn)TTK基因在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織，臨床樣本驗(yàn)證也證實(shí)TTK在HCC的高表達(dá)。TTK的高表達(dá)與患者HCC病程進(jìn)展密切相關(guān)：TTK在病理晚期和組織分化差樣本中，表達(dá)量更高。生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)TTK與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)。接著用ROC分析探索了TTK診斷HCC結(jié)局、預(yù)測病理和組織方面其檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。發(fā)現(xiàn)TTK在預(yù)測患者HCC或正常疾病狀態(tài)方面，AUC=0.971，表明TTK評(píng)價(jià)患者HCC檢驗(yàn)效能良好。本研究將數(shù)據(jù)挖掘和臨床驗(yàn)證結(jié)合起來，證明了TTK在HCC組織中的高表達(dá)，與疾病惡化和預(yù)后密切相關(guān)，且可作為潛在HCC預(yù)后和診斷靶標(biāo)，但未能對TTK影響HCC進(jìn)展的機(jī)制進(jìn)行基礎(chǔ)研究。本研究將為尋找肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)測預(yù)后的靶標(biāo)提供一定的理論依據(jù)和臨床指導(dǎo)。