杜偉 王山水 張煥煥

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 青島 266071；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬高唐縣人民醫(yī)院ICU，山東 聊城 252800；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬高唐縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 聊城 252800)

肺癌是世界上最主要的惡性腫瘤[1]。盡管肺癌治療技術(shù)的不斷發(fā)展，但患者5年生存率仍然很低[2]。此外，肺癌患者在治療后經(jīng)常復(fù)發(fā)，甚至出現(xiàn)在早期。因此，深入了解肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的治療靶點(diǎn)和開發(fā)新的治療方法具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coddg RNAs, LncRNA)是一種有200多個(gè)核苷酸且缺乏開放閱讀框架的RNA[3]。LncRNA參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移[4-5]。印跡基因H19是1990年首次發(fā)現(xiàn)的LncRNA。H19在多種癌癥中異常表達(dá)，包括胃癌、肺癌、結(jié)腸癌和肝癌[6-7]。研究表明，H19調(diào)控上-皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8]。另外研究表明LncRNA通過(guò)海綿吸附微小RNA(miRNA)來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能[9]。例如，H19海綿miR-138提高HMG1的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的遷移和侵襲[10]。LncRNAH19通過(guò)靶向miR-675/EHZ2調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[11]。miR-141通過(guò)調(diào)控LncRNA H19和LncRNA H19衍生的miR-675的靶基因調(diào)控成骨細(xì)胞增殖[12]。有報(bào)道稱H19在肺癌中過(guò)表達(dá)，并與細(xì)胞增殖相關(guān)，但目前尚不清楚H19在肺癌中是否還有其他功能及作用機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)程和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中LncRNA H19與miR-675具有靶向作用[13-15]，然而在肺癌SPC-A1細(xì)胞發(fā)展中二者是否具有同樣的靶向作用仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)探討LncRNA H19對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞發(fā)展的影響，進(jìn)一步闡明肺癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑 肺癌SPC-A1細(xì)胞、A549細(xì)胞、HCC827細(xì)胞和人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基選購(gòu)自山東致圣生物科技有限公司。Trizol購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。H19 siRNA、pcDNA-H19、CDH13 siRNA等質(zhì)粒由上海生物工程有限公司合成。Transwell小室購(gòu)自Corning公司。miR-675抑制劑和miR-675模擬物來(lái)自Genepharma公司。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、GAPDH及其CDH13抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將肺癌SPC-A1細(xì)胞、A549細(xì)胞、HCC827細(xì)胞和人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素，細(xì)胞匯合至95%時(shí)消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞至生長(zhǎng)密度為 90% 左右時(shí)加入胰蛋白酶消化，用含10% FBS的 DMEM 重懸細(xì)胞并接種至12孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜孵育，觀察細(xì)胞密度達(dá) 70% 時(shí)，PBS 清洗 1 次，用Turbofect試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞，持續(xù)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定 以1.5×103/孔的密度將SPC-A1細(xì)胞接種于96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，用Turbofect試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞，48 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。檢測(cè)時(shí)每孔細(xì)胞加入20 μL 濃度為5 mg/mL的噻唑藍(lán)(MTT)，孵育 4 h，每孔細(xì)胞加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，10 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm 處測(cè)量各孔細(xì)胞吸光度值，重復(fù)3次后取平均值。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 先進(jìn)行LncRNA H19及其miR-675靶基因的預(yù)測(cè)，接著構(gòu)建H19野生型、H19突變型、CDH13 野生型、CDH13突變型載體，再分別與Genepharma公司合成的miR-675模擬物、模擬物對(duì)照共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，分析48 h后的熒光素酶活性。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將已鋪好Matrigel 基質(zhì)的Transwell上室靜置12 h。將轉(zhuǎn)染 48 h 的SPC-A1細(xì)胞常規(guī)消化，用無(wú)FBS的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1.0×105/mL，將稀釋后的200 μL 細(xì)胞懸液加入小室上層，Transwell下層加入500 μL含10% FBS的DMEM，培養(yǎng)箱孵育24 h，4%多聚甲醛固定SPC-A1細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色浸染20 min，置于顯微鏡下觀察SPC-A1細(xì)胞侵襲情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR 利用 Trizol 法分別提取轉(zhuǎn)染成功的SPC-A1細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green RT-PCR試劑盒按照說(shuō)明書的方案進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，以 GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算2-△△Ct值作為相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次以上。 反應(yīng)如下: 95℃預(yù)變性 20 s，95℃ 10 s，60℃ 退火 20 s，72℃ 延伸10 s，共 40 個(gè)循環(huán)。RT-qPCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功后的SPC-A1細(xì)胞總蛋白 提取轉(zhuǎn)染成功后的SPC-A1細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，與特異性一抗(GAPDH、E-cadherin、N-cadherin和CDH13)在4℃孵育過(guò)夜; TBST清洗膜5次，PVDF膜與二抗 37℃孵育1 h; TBST洗膜5次，根據(jù)蛋白大小分析條帶。

2 結(jié)果

2.1 H19 siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞后分析敲低H19表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及EMT的影響 首先利用RT-qPCR技術(shù)分析了SPC-A1、A549、HCC827細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞中H19的差異表達(dá)，結(jié)果顯示SPC-A1(2.98±0.25)、A549(2.47±0.75)、HCC827(2.06±0.51)細(xì)胞中LncRNA H19表達(dá)量明顯高于BEAS-2B細(xì)胞(1.25±0.16)(P<0.05)，且LncRNA H19在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)量最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SPC-A1細(xì)胞用于研究。培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染H19 siRNA及其對(duì)照siRNA NC質(zhì)粒，48 h后分析細(xì)胞活性，分析MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA敲低H19在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)后顯著下調(diào)細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖1A；進(jìn)一步分析Western blot及其Transwell結(jié)果可知，siRNA能敲降H19在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)后明顯降低了N-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，并減少了細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.05)，卻上調(diào)了E-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，見(jiàn)圖1B～E。

圖1 下調(diào)LncRNA H19抑制SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

2.2 LncRNA H19直接靶向結(jié)合miR-675 先通過(guò)miRanda分析預(yù)測(cè)LncRNA H19 3′UTR與其潛在作用靶點(diǎn)miR-675的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。后續(xù)研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染H19 wt的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，miR-675 mimics組SPC-A1細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于mimics NC組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染H19 mut的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，和mimics NC組對(duì)比，miR-675 mimics組SPC-A1細(xì)胞熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2B。RT-qPCR結(jié)果顯示，LncRNA H19 siRNA組SPC-A1細(xì)胞內(nèi)miR-675表達(dá)量(1.83±0.98)明顯高于siRNA NC組(0.92±0.27)(P<0.05)。

圖2 miRanda及其雙熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證LncRNA H19與miR-675之間的靶向關(guān)系

2.3 下調(diào)miR-675促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT 首先利用RT-qPCR技術(shù)分析了SPC-A1和BEAS-2B細(xì)胞中miR-675的差異表達(dá)，結(jié)果顯示SPC-A1細(xì)胞中miR-675表達(dá)量(0.27±0.83)明顯低于BEAS-2B細(xì)胞(1.09±0.53)(P<0.05)。培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-675 inhibitor及其對(duì)照inhibitor NC質(zhì)粒，48 h后分析細(xì)胞活性，分析MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降miR-675在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)后顯著上調(diào)細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖3A；進(jìn)一步分析Western blot及其Transwell結(jié)果可知，敲降miR-675在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)后明顯降低了E-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，并上調(diào)了細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.05)和N-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，見(jiàn)圖3B～E。

圖3 下調(diào)miR-675促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

2.4 過(guò)表達(dá)LncRNA H19與miR-675后進(jìn)一步分析SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT情況 過(guò)表達(dá)H19后顯著上調(diào)了SPC-A1細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲數(shù)目與N-cadherin表達(dá)(P<0.05)，卻下調(diào)了E-cadherin表達(dá)(P<0.05)，而過(guò)表達(dá)miR-675顯著下調(diào)了細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲數(shù)目與N-cadherin表達(dá)(P<0.05)，卻上調(diào)了E-cadherin表達(dá)(P<0.05)。與過(guò)表達(dá)miR-675組對(duì)比，過(guò)表達(dá)H19及miR-675上調(diào)了SPC-A1細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲數(shù)目與N-cadherin表達(dá)(P<0.05)，卻下調(diào)了E-cadherin表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 上調(diào)Lnc RNA H19通過(guò)miR-675促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

2.5 miR-675與CDH13之間的靶向和負(fù)調(diào)控關(guān)系 TargetScan預(yù)測(cè)的miR-675與CDH13的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。轉(zhuǎn)染CDH13 wt的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，miR-675 mimics組SPC-A1細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于mimics NC組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染CDH13 mut的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，和mimics NC組對(duì)比，miR-675 mimics組SPC-A1細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖5B。RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-675inhibitor組SPC-A1細(xì)胞內(nèi)CDH13表達(dá)量(2.03±0.45)明顯高于inhibitor NC組(1.03±0.54)(P<0.01)。

圖5 TargetScan及其雙熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證miR-675與CDH13的關(guān)系

2.6 CDH13 siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞后分析敲低CDH13表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及EMT的影響 首先利用RT-qPCR技術(shù)分析了SPC-A1和BEAS-2B細(xì)胞中CDH13的差異表達(dá)，結(jié)果顯示SPC-A1細(xì)胞中CDH13表達(dá)量(2.21±0.52)明顯高于BEAS-2B細(xì)胞(1.13±0.45)(P<0.05)。培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染CDH13 siRNA及其對(duì)照siRNA NC質(zhì)粒，48 h后分析細(xì)胞活性，分析MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA能敲降CDH13在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)后顯著下調(diào)細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖6A；進(jìn)一步分析Western blot及其Transwell結(jié)果可知，siRNA技能敲降CDH13在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)后明顯降低了N-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，并減少了細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.05)，卻上調(diào)了E-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，見(jiàn)圖6B～E。

圖6 下調(diào)CDH13抑制SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

2.7 LncRNA H19、miR-675與CDH13之間的調(diào)控關(guān)系 pcDNA-H19+mimics NC組CDH13 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于pcDNA-3.1(+)+mimics NC組，pcDNA-3.1(+)+miR-675 mimics組CDH13 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯低于pcDNA-3.1(+)+mimics NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pcDNA-H19+miR-675 mimics組CDH13 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯高于pcDNA-3.1(+)+miR-675 mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。以上結(jié)果表明LncRNA H19與CDH13存在正調(diào)控關(guān)系，miR-675與CDH13存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，LncRNA H19可能通過(guò)miR-675調(diào)控CDH13表達(dá)。

圖7 LncRNA H19、miR-675與CDH13之間的調(diào)控關(guān)系

3 討論

近年來(lái)，盡管肺癌發(fā)病機(jī)制的研究有了突破性的進(jìn)展，但晚期肺癌患者的預(yù)后仍然不理想。因此，揭示控制這種惡性表型的分子開關(guān)，闡明肺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)化的潛在機(jī)制具有重要意義。大多數(shù)人類惡性腫瘤起源于上皮組織，EMT的研究不僅有利于肺癌，也有利于大部分實(shí)體惡性腫瘤。然而，目前對(duì)于LncRNA和其他RNA轉(zhuǎn)錄本在調(diào)控EMT中的功能作用知之甚少。近年來(lái)，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA作為一類新的調(diào)控基因表達(dá)的功能調(diào)控元件出現(xiàn)，許多LncRNA與多種人類疾病有關(guān)[16-17]。近些年研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19參與調(diào)控各種癌癥的發(fā)展[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA H19的下調(diào)可通過(guò)調(diào)控miR-18b/IGF1軸使順鉑致敏黑色素瘤細(xì)胞[19]。高水平的LncRNA H19表達(dá)與食管鱗癌患者更短的生存期相關(guān)[20]。此外，抑制LncRNAH19在非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)具有抗腫瘤和增強(qiáng)對(duì)吉非替尼和化療敏感性的作用[21]。以上研究充分說(shuō)明了LncRNA H19在腫瘤細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，而且我們還發(fā)現(xiàn)LncRNA H19在癌細(xì)胞中異常表達(dá)后會(huì)行使生物學(xué)功能。因此我們?cè)诒狙芯恐惺紫葯z測(cè)了LncRNA H19是否在肺癌細(xì)胞中有差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA H19在肺癌SPC-A1細(xì)胞、A549細(xì)胞、HCC827細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且在SPC-A1細(xì)胞中表達(dá)量最高。后續(xù)功能研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19是調(diào)節(jié)EMT進(jìn)展的新參與者，過(guò)表達(dá)H19可以顯著促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞的增殖和侵襲[22]。我們的研究結(jié)果也表明H19在肺癌進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用，值得進(jìn)一步深入探討。

研究表明LncRNA可以調(diào)控miRNA在癌癥發(fā)展中的功能[23]。有報(bào)道稱，H19作為分子海綿拮抗let-7家族，從而調(diào)控各種生物學(xué)過(guò)程[24]。H19也可抑制喉鱗癌中的miR-148a-3p[21]。另外發(fā)現(xiàn)LncRNA H19通過(guò)miR-29b-3p作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA調(diào)控膀胱癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[25]。此外，LncRNA H19過(guò)表達(dá)通過(guò)miR-29b-3p靶向MCL-1誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤硼替佐米耐藥[26]。本研究發(fā)現(xiàn)H19靶向且負(fù)調(diào)控了SPC-A1細(xì)胞中miR-675的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)可以推斷miR-675在H19下游發(fā)揮作用。我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-675在腫瘤細(xì)胞惡性發(fā)展進(jìn)程中具有明顯的抑癌作用，在癌細(xì)胞中表達(dá)量顯著下調(diào)[27]。因此我們繼續(xù)研究了miR-675的生物學(xué)功能，研究結(jié)果表明miR-675在SPC-A1細(xì)胞中表達(dá)量明顯下降，下調(diào)miR-675促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT，而上調(diào)LncRNA H19通過(guò)miR-675促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT，這表明在肺癌中H19調(diào)控的SPC-A1細(xì)胞增殖和侵襲可能受miR-675表達(dá)的調(diào)控。此外，TargetScan預(yù)測(cè)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們miR-675和CDH13具有靶向關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)CDH13在SPC-A1細(xì)胞中發(fā)揮了明顯的促癌作用，這與CDH13在結(jié)直腸癌、食管癌及乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮的作用一致[28]。我們還發(fā)現(xiàn)LncRNA H19不僅能海綿miR-675，還能夠上調(diào)CDH13表達(dá)，表明LncRNA H19對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖、侵襲和EMT的影響是通過(guò)海綿miR-675和上調(diào)CDH13表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論與啟示

本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19作為一種致癌基因，通過(guò)海綿miR-675和上調(diào)CDH13促進(jìn)了肺癌SPC-A1細(xì)胞的發(fā)展，其可能是治療肺癌的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)，可進(jìn)一步深入研究。