鄧蕊 柴克霞 馬苗

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，青海 西寧 810001)

特發(fā)性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是一種以肌無力和肌肉炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，包括多發(fā)性肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎、免疫介導(dǎo)的壞死性肌病和抗合成酶綜合征[1-2]；其主要表現(xiàn)為肌無力、肌痛，出現(xiàn)特征性皮疹，血清肌酶水平升高，肌肉活檢顯示肌纖維變性和再生、慢性單核細(xì)胞浸潤(rùn)及肌束周圍萎縮[3]。目前IIM發(fā)病機(jī)制仍不清楚，多認(rèn)為是遺傳、環(huán)境、免疫機(jī)制和非免疫機(jī)制(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧的產(chǎn)生、自噬調(diào)節(jié)異常、缺氧、血管新生)等多因素相互作用的結(jié)果[3]。國(guó)內(nèi)外多采用兔或豚鼠骨骼肌勻漿免疫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎(Experimental autoimmune myositis,EAM)動(dòng)物模型，其操作簡(jiǎn)單、成本較低、建模效果好，為研究IIM提供了良好的基礎(chǔ)[4-5]。

鐵死亡是一種鐵依賴性的,以細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)累積為特征的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式[6]。參與鐵死亡的ROS有多種產(chǎn)生來源，除了鐵介導(dǎo)的芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS外，依賴NADPH的NADPH氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases,NOXs)和谷胱甘肽的耗竭同樣對(duì)ROS的產(chǎn)生起著重要作用[7]?；钚匝鯙橐幌盗蟹肿友醯难苌?，主要包括非自由基(H2O2、ROOH、1O2、O3、HOCl、HOBr)和自由基(O2·-、·OH、ROO·、RO·)。適量的ROS可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，參與細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)；然而當(dāng)ROS生成量超過機(jī)體調(diào)節(jié)能力時(shí)，則會(huì)引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞生理功能紊亂，觸發(fā)細(xì)胞損傷或死亡[8]。研究表明，NOXs是體內(nèi)ROS的重要來源，細(xì)胞通過依賴NADPH的電子還原系統(tǒng)將體內(nèi)的氧分子還原成超氧陰離子，各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等刺激均可活化NOXs，消耗NADPH，產(chǎn)生大量的ROS[9]。NOXs有7種亞型，分別是NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1及DUOX2，骨骼肌組織表達(dá)三種NOXs亞型(NOX1、NOX2和NOX4)，NOX1在骨骼肌組織中的生理作用尚未明確，NOX2和NOX4是骨骼肌組織中ROS的主要來源[10]。有研究報(bào)道當(dāng)骨骼肌組織肌管中產(chǎn)生大量ROS時(shí)可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，線粒體功能障礙，進(jìn)而發(fā)生肌肉收縮功能失調(diào)、肌無力[11-12]。NOXs介導(dǎo)的ROS已被證實(shí)參與了代謝性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生、發(fā)展過程[9，13]，而在IIM中的作用尚不清楚。本研究通過檢測(cè)EAM小鼠骨骼肌組織中NADPH、NOX2、NOX4和ROS的表達(dá)情況，探討NOXs中的NOX2和NOX4介導(dǎo)的ROS在IIM發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 豚鼠與BALB/c小鼠均購(gòu)自西安科奧生物科技有限公司，飼養(yǎng)于青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度保持在22℃～25℃，濕度50%左右，明暗交替周期為12 h，每?jī)扇崭鼡Q一次墊料以保持生存環(huán)境清潔干燥，每日添加飼料并更換清潔水。健康雌性豚鼠2只，體重300～350 g，用于制備豚鼠骨骼肌勻漿蛋白；健康雌性BALB/c小鼠7～8周齡，14只,體重18～22 g。本研究通過動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 本研究中所選用的試劑及抗體購(gòu)自南京建成生物工程研究所、武漢賽維爾生物科技有限公司及武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豚鼠骨骼肌勻漿蛋白的制備 5%水合氯醛麻醉豚鼠，在消毒條件下立即留取其四肢骨骼肌，冰浴條件下剔除神經(jīng)、血管、筋膜等組織；稱重后放入4℃預(yù)冷的PBS液中，使用無菌外科剪剪碎組織，按每20 mg組織加入150 uL裂解液的比例加入裂解液，放置30 min，冰水浴中用刀式勻漿機(jī)5000 rpm進(jìn)一步破碎組織，每勻漿30 s停30 s，反復(fù)多次，直至組織破碎成糊狀；用生理鹽水稀釋后經(jīng)無菌紗布過濾，收集濾液，低溫離心機(jī)15000 rpm，4℃離心15 min，取上清液采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，用PBS液配置其終濃度為20 mg/mL，-80℃冰箱分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 建立EAM小鼠模型及分組 造模成功的判定方法 末次免疫處理一周后，通過觀察小鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行臨床評(píng)分、檢測(cè)小鼠四肢的肌力、測(cè)量小鼠體重、測(cè)定血清CK水平以及對(duì)小鼠四肢骨骼肌組織HE染色結(jié)果進(jìn)行病理評(píng)級(jí)來判定造模是否成功。①臨床表現(xiàn)評(píng)分：觀察小鼠毛發(fā)的變化、姿勢(shì)的改變、聲音的轉(zhuǎn)變等。采用Lennon等[14]臨床表現(xiàn)評(píng)分方法：0分，無肌無力；1分，咬嚙/喊叫無力；2分，休息時(shí)體位隆起，頭下垂，前肢屈曲，行走震顫；3分，嚴(yán)重肌無力，無喊叫，體重減輕，嚴(yán)重的有肌肉萎縮、呼吸困難、瀕于死亡(表現(xiàn)居中者分別評(píng)分為0.5、1.5、2.5分)。②小鼠肌力測(cè)定[15]：用翻轉(zhuǎn)屏(一個(gè)50 cm2鐵絲網(wǎng)，由直徑為1 mm的金屬絲組成網(wǎng)眼大小為12 mm2的屏障)測(cè)定肌力，將小鼠放在該鐵絲網(wǎng)屏障中央，立即倒置屏障，使小鼠的頭部下降，屏障平穩(wěn)地置于墊子上方約20 cm，秒表記錄小鼠掉落前持續(xù)的時(shí)間，每只小鼠連續(xù)測(cè)定5次，取平均值作為該小鼠的肌力測(cè)定值，時(shí)間越短提示肌力越差。③肌肉病理分級(jí)：依據(jù)Matsumoto等[16]肌肉組織HE染色病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，未發(fā)現(xiàn)病灶；1級(jí)，累及1～5個(gè)纖維；2級(jí)，累及6～30個(gè)纖維；3級(jí)，累及整個(gè)肌纖維束；4級(jí)，累及超過一個(gè)肌纖維束或整塊肌肉組織(1級(jí)記1分；肌肉病變居中者可增加0.5分)。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理?？漆t(yī)師采用雙盲法對(duì)每只小鼠四肢的四塊肌肉組織的HE染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，取平均值作為每只小鼠的組織病理學(xué)得分。EAM組小鼠在背部脊柱旁、尾根部及左右后肢皮下多點(diǎn)注射免疫混懸液(0.25 mL豚鼠骨骼肌勻漿蛋白與0.25 mL完全弗氏佐劑的混懸液)，每周1次，連續(xù)注射6周，前三周免疫處理的同時(shí)腹腔注射百日咳毒素500 ng(用200 μL生理鹽水稀釋)。對(duì)照組小鼠在相同條件下相同部位注射同等劑量的對(duì)照混懸液(0.25 mL無菌生理鹽水與0.25 mL完全弗氏佐劑的混懸液)，每周1次，共注射6次。對(duì)照組6只，體重(20.25±1.29)g；EAM組8只，體重(20.48±1.13)g。兩組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2.3 標(biāo)本的采集與處理 ①血清標(biāo)本：于末次免疫一周后，測(cè)量各組小鼠體重，按0.1 mL/10 g給予5%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，經(jīng)眼球取血，采血過程避免溶血，使用EP管留存1 mL，隨后低溫離心機(jī)3000 rpm，4℃離心10 min，離心后分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酸激酶(CK)水平。②肌肉標(biāo)本：經(jīng)眼球取血后，留取四肢骨骼肌，剔除神經(jīng)、血管及筋膜，一部分組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、制片，用于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NOX2和NOX4及HE染色；另一部分組織立即置于液氮中冷凍數(shù)秒，隨后進(jìn)行組織勻漿，用于分光光度法及ELISA法分別檢測(cè)NADPH和ROS。

1.2.4 HE染色檢測(cè)兩組小鼠骨骼肌組織病理改變 石蠟切片脫蠟脫苯至水，經(jīng)蘇木素染色、鹽酸分化、伊紅染色后，脫水透明封片，光鏡下觀察骨骼肌組織病理改變。

1.2.5 分光光度法檢測(cè)兩組小鼠骨骼肌組織中NADPH的含量 稱取約0.1 g組織加入1 mL堿性提取液，冰浴研磨，95℃水浴5 min(蓋緊防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g 4℃離心10 min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4℃離心10 min，取上清，嚴(yán)格按照說明書測(cè)定步驟加入試劑，混勻，波長(zhǎng)570 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零測(cè)定樣本吸光值，代入公式計(jì)算NADPH含量。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組小鼠骨骼肌組織中NOX2和NOX4的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；滴加3%H2O2，37℃濕盒孵育10 min；PBS緩沖液洗3次，每次5 min；擦干，浸入0.01 mol枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中高壓鍋煮沸15 min；室溫冷卻后重復(fù)步驟三，擦干，滴加5%BSA封閉液，37℃濕盒孵育30 min；甩干勿洗，滴加一抗工作液，4℃濕盒孵育過夜；移去一抗，重復(fù)步驟三，擦干，滴加二抗工作液，37℃濕盒孵育30 min，重復(fù)步驟三；擦去多余PBS液，滴加新鮮配制DAB工作液，鏡下監(jiān)測(cè)染色程度，蒸餾水洗3次，每次5 min；擦干，蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗；1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗；常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。顯微鏡下觀察，每張切片先在低倍鏡(100×)下選取細(xì)胞密集區(qū)域，再用高倍鏡(400×)拍照，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，陽(yáng)性染色呈淡黃色、棕黃色或棕褐色，計(jì)算陽(yáng)性著色細(xì)胞占比，NOX2及NOX4主要表達(dá)在胞膜及胞漿[17]。反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照許良中[18]標(biāo)準(zhǔn)，首先將染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分乘積進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評(píng)分，每張切片的得分取10個(gè)視野的平均分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積>3分才算免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)兩組小鼠骨骼肌組織中ROS的含量 稱取約0.1 g組織加入0.9 mLPBS，冰浴條件下使用勻漿器將標(biāo)本充分勻漿，低溫離心機(jī)5000rpm，4℃離心15 min，收集上清液，分裝后一份待檢測(cè)，其余-20℃冷凍備用。

2 結(jié)果

2.1 EAM小鼠模型造模成功的結(jié)果判定 造模過程中對(duì)照組小鼠無死亡；EAM組有2只小鼠死亡，其中1只死于第4次免疫處理次日，另1只死于第5次免疫處理后2 h，其余小鼠均順利完成造模過程。

2.1.1 小鼠臨床表現(xiàn)、臨床評(píng)分及體重變化 對(duì)照組小鼠活動(dòng)姿勢(shì)正常，叫聲響亮，進(jìn)食良好，體重穩(wěn)定増長(zhǎng)。其中有2只小鼠在第3次注射后，背部出現(xiàn)直徑約0.3～0.5 cm的不規(guī)則區(qū)域毛發(fā)脫落，未出現(xiàn)硬結(jié)、紅腫、破潰等現(xiàn)象，其余小鼠毛發(fā)整齊有光澤，未出現(xiàn)脫毛等現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠臨床評(píng)分為0分。EAM組小鼠在第2次免疫注射后背部注射部位出現(xiàn)毛發(fā)脫落，其中2只小鼠背部出現(xiàn)0.2～0.3 cm的硬結(jié)；第3次注射后，全部小鼠背部注射部位出現(xiàn)硬結(jié)、紅腫，此時(shí)出現(xiàn)肌無力的表現(xiàn)，行走時(shí)后肢拖杳；第4次注射后，注射部位出現(xiàn)紅腫、破潰現(xiàn)象，全部小鼠毛發(fā)凌亂、無光澤，進(jìn)食減少，體重增長(zhǎng)減慢或不増長(zhǎng)，休息時(shí)背部隆起，其中一只小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肌肉萎縮、呼吸急促、進(jìn)食費(fèi)力等癥狀，于次日死亡；第5次注射后，小鼠背部出現(xiàn)多個(gè)硬結(jié)，多個(gè)注射部位均有脫毛、破潰、流膿現(xiàn)象，叫聲嘶啞，行走拖沓，直立困難，其中一只小鼠2 h后死亡；第6次注射后，小鼠背部大片的毛發(fā)脫落，破潰流膿現(xiàn)象嚴(yán)重，活動(dòng)能力明顯下降或不活動(dòng)，進(jìn)食費(fèi)力，呼吸急促，見圖1。EAM組小鼠臨床評(píng)分為2.0～3.0分，平均(2.33±0.41)分。與對(duì)照組相比，末次免疫后1周EAM組小鼠體重下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 兩組小鼠臨床表現(xiàn)

2.1.2 小鼠肌力測(cè)定時(shí)間及血清CK水平 EAM組小鼠肌力測(cè)定時(shí)間較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EAM組小鼠血清CK水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.1.3 小鼠骨骼肌組織病理改變及病理學(xué)評(píng)分 兩組小鼠骨骼肌組織HE染色圖見圖2。對(duì)照組小鼠骨骼肌肌纖維大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本正常，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見肌纖維萎縮、變性、壞死。EAM組小鼠骨骼肌肌纖維大小不一、粗細(xì)不等，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見不同程度萎縮、變性、壞死。EAM組小鼠骨骼肌組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。根據(jù)造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究成功建立EAM小鼠動(dòng)物模型。

表1 兩組小鼠的體重、肌力測(cè)定時(shí)間、血清CK水平及骨骼肌組織HE染色評(píng)分結(jié)果比較

2.2 小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的陽(yáng)性表達(dá)率 EAM組小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的陽(yáng)性表達(dá)率結(jié)果[n(×10-2)]

2.3 小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的免疫組化評(píng)分 兩組小鼠骨骼肌組織中NOX2與NOX4的免疫組化結(jié)果見圖2。NOX2和NOX4在EAM組小鼠骨骼肌組織中的免疫組化評(píng)分高于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

圖2 兩組小鼠骨骼肌組織HE染色圖及NOX2與NOX4免疫組化圖(400×)

2.4 小鼠骨骼肌組織中NADPH和ROS的含量 與對(duì)照組相比，EAM組小鼠骨骼肌組織中NADPH含量明顯降低，ROS含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組小鼠骨骼肌組織中NADPH、ROS的含量及NOX2、NOX4免疫組化評(píng)分結(jié)果比較

2.5 相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示，EAM組小鼠骨骼肌組織中ROS的含量與NOX2、NOX4的免疫組化評(píng)分均呈正相關(guān)，而與NADPH的含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；EAM組小鼠骨骼肌組織HE染色病理學(xué)評(píng)分與NOX2、NOX4的免疫組化評(píng)分及ROS的含量均呈正相關(guān)，而與NADPH的含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 EAM組小鼠骨骼肌組織中有關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

研究證實(shí)，IIM的發(fā)病與許多特定的環(huán)境危險(xiǎn)因素如細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染，職業(yè)性接觸灰塵、氣體或煙霧，紫外線照射等有關(guān)[19]。此外在IIM的發(fā)病過程中會(huì)產(chǎn)生大量活化的補(bǔ)體、致病性的自身抗體、免疫復(fù)合物及細(xì)胞因子等[20]；其次，有研究顯示，缺氧及血管新生也參與了IIM的發(fā)病過程[20-22]。血管新生可能是對(duì)缺氧環(huán)境做出的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種常見的促血管生成因子，通過與受體(VEGFR)結(jié)合上調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)血管新生，而VEGF與VEGFR的結(jié)合亦可通過激活亞基Rac進(jìn)而激活NOXs[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道NOXs是體內(nèi)重要的敏感性氧感受器，在缺氧條件下也可通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)來促進(jìn)血管生成，VEGF和NOXs可以相互促進(jìn)彼此間的表達(dá)或激活[23-24]。本研究認(rèn)為在EAM小鼠體內(nèi)這些異常的刺激因素可能激活了NOXs，使得EAM小鼠骨骼肌組織中NOX2和NOX4的表達(dá)水平升高，而高表達(dá)的NOX2和NOX4介導(dǎo)生成高濃度的ROS，大量的ROS可降低細(xì)胞呼吸速率并減少ATP的產(chǎn)生，造成細(xì)胞內(nèi)能量不足、線粒體功能障礙及關(guān)鍵肌肉組分的損傷，從而誘導(dǎo)骨骼肌組織萎縮及功能喪失，并參與維持骨骼肌組織的炎癥進(jìn)展。

NADPH是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不可或缺的組成成分，在細(xì)胞防御ROS氧化性損傷方面起著重要作用[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)NADPH的水平是鐵死亡敏感性的生物標(biāo)志，在鐵死亡發(fā)生過程中，NADPH的水平降低，而高水平的NADPH則會(huì)抵抗鐵死亡的發(fā)生[26]。鐵死亡的發(fā)生需要一定水平的NADPH作為電子供體，產(chǎn)生ROS；而在鐵死亡發(fā)生過程中，NADPH提供了電子被還原成NADP++H+，因此NADPH的水平下降；正常生理情況下，NADPH的分解與合成處于相對(duì)平衡狀態(tài)，而在炎癥、疾病等條件下，NADPH更傾向于在NOXs的作用下產(chǎn)生ROS，誘發(fā)鐵死亡[27]。本研究認(rèn)為在EAM小鼠體內(nèi)NADPH一方面被消耗，用于產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)鐵死亡，并且NOXs活化越多，NADPH消耗越多，隨之生成的ROS水平越高；另一方面，NADPH還可以被高水平的ROS氧化，從而造成NADPH含量進(jìn)一步降低。而對(duì)照組小鼠相比于EAM組小鼠，體內(nèi)的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、抗體補(bǔ)體等成分較少，因此NOXs可能處于靜息狀態(tài)，從而NADPH的水平處于氧化還原平衡狀態(tài)，ROS的含量也維持在生理水平。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在疾病狀態(tài)下，NOX2參與了肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌纖維萎縮和收縮功能障礙的病理生理學(xué)進(jìn)展[11，28]，NOX4介導(dǎo)產(chǎn)生的超氧化物通過過氧亞硝酸鹽和瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道等機(jī)制誘發(fā)骨骼肌肥大[29]；其次，活化后的NOX2和NOX4，通過消耗NADPH，介導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，高濃度的ROS可直接作用于脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子，造成脂質(zhì)過氧化、誘導(dǎo)基因突變和蛋白質(zhì)變性，除此以外，還可損傷線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體等重要細(xì)胞器的功能，激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷及炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生[30]；再次，炎癥反應(yīng)、受損的生物大分子及細(xì)胞器介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子與炎癥因子又會(huì)進(jìn)一步激活NOX2和NOX4，生成更多的ROS，對(duì)ROS的產(chǎn)生發(fā)揮正反饋?zhàn)饔貌⒁l(fā)氧化損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡反應(yīng)程度愈加強(qiáng)烈。因此在EAM小鼠骨骼肌組織中，NOX2/NOX4的表達(dá)水平越高，NADPH被大量消耗，ROS的含量越多，細(xì)胞鐵死亡反應(yīng)越強(qiáng)，體內(nèi)氧化還原反應(yīng)嚴(yán)重失衡，骨骼肌組織炎癥反應(yīng)越顯著、損傷程度越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)EAM組小鼠骨骼肌組織中NOX2、NOX4的表達(dá)及ROS的含量均較對(duì)照組升高，而NADPH的含量較對(duì)照組降低；與此同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)EAM組小鼠骨骼肌組織中ROS的含量與NOX2、NOX4的免疫組化評(píng)分均成正相關(guān)，而與NADPH的含量成負(fù)相關(guān)；此外，EAM組小鼠骨骼肌組織HE染色病理學(xué)評(píng)分與NOX2、NOX4的免疫組化評(píng)分及ROS的含量均成正相關(guān)，而與NADPH的含量成負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果提示鐵死亡相關(guān)的NOXs介導(dǎo)的ROS可能參與了IIM的發(fā)病過程，并在IIM肌肉組織的損傷中發(fā)揮重要作用。

NOXs介導(dǎo)的ROS可能通過鐵死亡途徑參與了IIM的發(fā)病過程，并且NOXs可能是通過消耗NADPH產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化性損傷并誘導(dǎo)鐵死亡反應(yīng)來參與IIM的發(fā)病。這為深入研究IIM的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向。但是由于IIM的發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，且本研究樣本量較小，故還需擴(kuò)大樣本量并增加NOX2、NOX4和ROS的抑制劑進(jìn)一步研究探討NOXs介導(dǎo)的ROS在IIM發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。

4 結(jié)論

NADPH氧化酶中的NOX2和NOX4可能通過消耗NADPH產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化性損傷并誘導(dǎo)鐵死亡反應(yīng)來參與IIM的發(fā)病。NADPH、NOX2、NOX4和ROS有望成為新的評(píng)價(jià)IIM肌肉組織損傷程度的指標(biāo)。