徐秋爽,馬琦,張麗麗,王茜蓮,張婷婷,迪麗達(dá)爾·多力坤,羅曉,安景榮·安治國(guó),徐斌,伊琦忠

抑郁障礙(MDD)是常見的嚴(yán)重精神疾病,全世界有超過3.5億人受該疾病困擾,已成為世界第4大疾病,并且患病人數(shù)還在快速增長(zhǎng)中[1]。近年來研究表明由腸道微生物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)成的雙向溝通途徑“微生物-腸-腦”軸,在MDD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,MDD患者腸道菌群構(gòu)成與健康人群有顯著差異[2]。人酪酪肽(PYY)作為腸-腦-軸中的腸道內(nèi)分泌代謝物,作用于迷走神經(jīng)上的傳入神經(jīng)元向大腦傳送信息,研究報(bào)道其受體Y4在大腦中表達(dá),Y4受體敲除與減少焦慮抑郁行為有關(guān)[3]。有研究證實(shí)伴有肥胖的、飲食失調(diào)的MDD患者空腹血漿PYY水平顯著高于正常人群[4-5]。而肥胖的人或高脂飲食人群通常有腸道菌群紊亂,腸道菌群組成的改變可通過微生物-腸-腦軸影響認(rèn)知、誘發(fā)焦慮抑郁行為。而益生菌如乳酸桿菌和神經(jīng)行為紊亂相關(guān)的癥狀[6]相關(guān)。因此,本次通過對(duì)首發(fā)未治療的MDD患者和健康對(duì)照者的腸內(nèi)乳酸桿菌相對(duì)含量和PYY水平及糖脂代謝指標(biāo)的比較研究,分析探討中國(guó)維吾爾人群MDD發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

為2020年1月至2021年3月在我院就診的83例首發(fā)維吾爾族抑郁障礙患者和85名同院體檢中心的維吾爾族健康對(duì)照,包括40例患者外周血樣本、40名健康者全血標(biāo)本及43例患者糞便樣本、45名健康者糞便樣本。兩組在年齡、性別方面均衡可比。見表1。

表1 兩組性別、年齡的比較(例數(shù)

對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn):①健康維吾爾族人群,無精神疾病且自愿參與本研究者；②年齡18～65歲；③健康問卷(patient health questionnaire-9,PHQ-9)得分≤4分,排除標(biāo)準(zhǔn):①入組前接受過任何形式精神治療；②其他精神疾病史；③因藥物或器質(zhì)性精神病引起的繼發(fā)性精神障礙；④有神經(jīng)系統(tǒng)疾病史；⑤有腦結(jié)構(gòu)異常的MRI證據(jù)；⑥采樣前1個(gè)月內(nèi)食用任何益生元、益生菌等功能性食品,或服用任何影響菌群組成的抗生素及其他藥物；⑦有重大疾病或內(nèi)分泌疾病(如心臟病、糖尿病)。所有參與研究者均知情同意,并經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):20201106-08)。

1.2 方法

1.2.1 糞便和血漿PYY濃度測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)法檢測(cè)血漿和糞便中PYY水平,試劑盒采用人酪酪肽(PYY)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒。對(duì)于有PYY的包被微孔,依次加入 HRP 標(biāo)記的捕獲抗體、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)抗體,孵育并徹底清洗。顏色隨著 TMB 底物在過氧化物酶催化下變成藍(lán)色而在酸的影響下最終變成黃色。色調(diào)與樣本中的PYY濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：利用 Curve Expert 1.30 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并轉(zhuǎn)換待測(cè)樣品蛋白濃度。具體為:從標(biāo)準(zhǔn)值和樣本值中減去S0孔的值,以標(biāo)準(zhǔn)品S1-S6將其繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)濃度值設(shè)置的是縱坐標(biāo)(即對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值設(shè)定為橫坐標(biāo)(即對(duì)數(shù)坐標(biāo)),然后把標(biāo)準(zhǔn)曲線繪到與其相應(yīng)的對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上,然后再按照樣品的OD值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上來標(biāo)定相應(yīng)的實(shí)際含量。最終計(jì)算乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),即樣品的實(shí)際濃度。

1.2.2 糖脂代謝指標(biāo)的測(cè)定 病例組及對(duì)照組受試者空腹血糖(blood-glucose,Glu)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)均采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)完成。

1.2.3 糞便DNA提取、乳酸桿菌含量的測(cè)定 稱取200 mg糞便樣本,使用康為糞便DNA提取試劑盒從糞便細(xì)菌基因組中分離純化提取DNA,最后得到糞樣中細(xì)菌總DNA。按說明書進(jìn)行操作,提取后迅速置于-20℃環(huán)境下保存待用。通過文獻(xiàn)查閱[7]及 Pubmed BLAST 比對(duì)設(shè)計(jì)引物,以 16S rDNA 為內(nèi)參,由通用生物公司合成。采用 QuantiNova-SYBR-Green PCR Kit 試劑盒(Cat.No.208054)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudioTM 6 Flex Real Time PCR System,Applied-System)PCR儀對(duì)目標(biāo)菌及內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增,每樣本重復(fù)3次。腸道細(xì)菌引物序列及退火溫度如下:腸道菌群通用引物,16S rDNA:上游引物:TCCTACGGGAGGCAGCAGT,下游引物:GGACTACCAGGGTATCTATCCTGTT,退火溫度58℃；乳酸桿菌:上游引物:TGGAAACAGGTGCTAATACCG,下游引物:GTCCATTGTGGAAGATTCCC,退火溫度58℃。根據(jù)Ct值2-ΔΔCT法計(jì)算乳酸桿菌相對(duì)含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)性分析討論P(yáng)YY與腸內(nèi)乳酸桿菌、抑郁程度及糖脂代謝指標(biāo)等的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸內(nèi)乳酸桿菌含量的比較

經(jīng)qRT-PCR檢測(cè),病例組腸內(nèi)乳酸桿菌含量(5.64±1.23)低于對(duì)照組(15.43±3.14),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.85,P<0.05)。

2.2 血漿、糞便PYY在組間的分布

病例組血漿PYY水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.18,P<0.05)；病例組糞便PYY水平為高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.18,P<0.05)。見表2。

表2 兩組PYY水平比較

2.3 病例組與對(duì)照組糖脂代謝指標(biāo)的比較

病例組血清GLU、TC、HDL、LDL水平均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。兩組TG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組糖脂代謝指標(biāo)比較

3 討論

多項(xiàng)研究表明抑郁障礙可能是多基因復(fù)雜遺傳性疾病,腸道菌群的改變可能是導(dǎo)致抑郁障礙的重要原因[2]。既往研究[7-8]顯示,與健康人群相比,MDD患者腸道微生物多樣性和豐度均明顯下降,本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)維吾爾MDD患者腸道乳酸桿菌含量下降,與既往研究結(jié)果一致。乳酸桿菌是一種對(duì)人體健康具有重要作用的益生菌,能促進(jìn)人體葉酸合成、減少腸內(nèi)同型半胱氨酸含量,而同型半胱氨酸與抑郁障礙的發(fā)病存在著關(guān)聯(lián)[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明抗抑郁藥物聯(lián)合補(bǔ)充益生菌療效優(yōu)于單用抗抑郁藥[10-11],并有臨床研究[12-13]顯示,乳酸桿菌增加量與HAMD減分率呈正相關(guān),補(bǔ)充乳酸桿菌能有效降低Beck量表評(píng)分。Yun等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能通過調(diào)節(jié)腸道菌群、激活核因子κB,抑制白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá),從而緩解應(yīng)激誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、抑郁和認(rèn)知障礙。本研究為乳酸桿菌與MDD關(guān)系提供了證據(jù),并為聯(lián)合益生菌治療MDD提供思路。

PYY是腸道L細(xì)胞分泌的胃腸激素,是一種對(duì)多種組織有抑制功能的胃腸激素,其受體分布于人體多種組織,包括胃腸組織、胰腺、下丘腦弓狀核、視前和背內(nèi)核、杏仁核內(nèi)側(cè)核、黑質(zhì)等[4],通過下丘腦影響進(jìn)食,參與消化協(xié)調(diào)、饑餓和飽腹信號(hào)傳遞以及能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),也參與情緒的控制和情緒的調(diào)節(jié)[15],并通過作用于邊緣系統(tǒng)和大腦皮質(zhì)調(diào)節(jié)感知、情緒等過程[4]。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)注射PYY可改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的抑郁樣行為[16]。LPS是細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分,能刺激細(xì)胞因子的形成,可引起抑郁樣行為。本研究中MDD患者空腹血漿及糞便中PYY水平均高于對(duì)照組。由此可見PYY作為腸-腦-軸雙向通道的中間介質(zhì),與抑郁障礙有密切聯(lián)系,但目前研究結(jié)果還不足以解釋其中因果關(guān)系,需更多研究加以闡明。

本研究中MDD患者存在糖脂代謝異常,病例組血漿GLU、TC、HDL、LDL水平均低于對(duì)照組?，F(xiàn)階段多項(xiàng)研究證實(shí)抑郁障礙與血脂異常之間存在一定關(guān)聯(lián),但在不同年齡、不同類型的MDD中表現(xiàn)出的血脂紊亂并不一致[17]。Wei等[18]分析了11項(xiàng)有關(guān)TG、HDL、TC、LDL水平的病例對(duì)照研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TG升高,HDL降低,其余指標(biāo)無顯著差異,而在Bharti等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)HDL與MDD沒有關(guān)聯(lián)。影響糖脂代謝的因素很多,包括遺傳和環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等。有人認(rèn)為腸道菌群失衡,短鏈脂肪酸生成減少,可能是影響正常糖脂代謝的因素之一[20-21]。MDD患者糖脂代謝異常的原因和機(jī)制及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尚待進(jìn)一步研究。膽固醇是類固醇相關(guān)激素合成的重要來源,與大腦發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān),TC、HDL、LDL水平降低可能會(huì)導(dǎo)致中樞5-羥色胺合成不足,使其功能減退,進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥狀的發(fā)生[22]。糖脂代謝異常與腸內(nèi)乳酸桿菌的相關(guān)性尚不能描述其間的因果關(guān)系,還待進(jìn)一步更深入的機(jī)制研究。其次,PYY被證實(shí)與代謝綜合征相關(guān)[23],通過抑制食欲、胰液分泌、減緩胃腸蠕動(dòng)等多方面調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝[24-25]。因此通過糾正MDD患者腸道微生態(tài)、降低PYY水平可以對(duì)糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的維持起到積極作用。

飲食是對(duì)腸道微生物構(gòu)成最重要的影響因素[26]。地中海式飲食模式下擬桿菌豐度升高、變形桿菌豐度降低[27],而西方飲食模式下擬桿菌豐度下降[28]。為控制不同人群之間飲食習(xí)慣、模式不同造成的誤差,因此本研究以中國(guó)維吾爾人群為研究對(duì)象。中國(guó)新疆日照時(shí)間長(zhǎng)、晝夜溫差大造成谷物中蛋白質(zhì)含量和水果中糖分增多,加之日常碳水化合物、脂肪和發(fā)酵乳制品攝入較多,維吾爾族人群腸道菌群構(gòu)成具有其特殊性[29],這些獨(dú)特的自然條件形成了當(dāng)?shù)厝巳喝粘Ｉ钪斜容^容易獲得提高腸道乳酸桿菌豐度的乳制品,這或許對(duì)MDD及糖脂代謝等慢性疾病的治療、康復(fù)和管理具有一定的幫助。

本研究不足之處是血液和糞便樣本不是來自同一個(gè)受試者,只能分別分析血漿、糞便中PYY水平與對(duì)照組之間的差異性,而不能確立血漿與糞便中PYY相關(guān)性。其次，臨床資料收集不全面,缺少了BMI、病程時(shí)間、受教育程度等有關(guān)影響腸道微生物菌群的混雜因素,使得腸內(nèi)乳酸桿菌與腸內(nèi)PYY、糖脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析不夠全面與深入。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)維吾爾人群首發(fā)抑郁障礙患者腸內(nèi)乳酸桿菌屬含量下降、PYY升高；維吾爾首發(fā)抑郁障礙患者存在糖脂質(zhì)代謝紊亂,為抑郁障礙發(fā)病機(jī)制提供一定支持。