成慧靈，周 美，許 茜，蔡 晶

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350122；3.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350117）

帕金森?。╬arkinson’s disease，PD）是目前僅次于阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease，AD）的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-4]。其病理改變多見(jiàn)為黑質(zhì)部位多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元缺失并伴有進(jìn)行性震顫、動(dòng)作延緩、肌肉僵硬和步態(tài)異常等表現(xiàn)[5-7]。目前，PD運(yùn)動(dòng)功能障礙與紋狀體內(nèi)DA神經(jīng)元數(shù)量的減少有著緊密的關(guān)系[8]。有報(bào)道，七氯（C10H5CL7，heptachlor）是一種有機(jī)氯化合物，具有較強(qiáng)毒性，近年來(lái)也被人們廣泛用于農(nóng)作物地下害蟲(chóng)的防治。但因其高度的親脂性可富集在動(dòng)物體內(nèi)脂肪中，特別是魚(yú)類和軟體動(dòng)物體內(nèi)多見(jiàn)，且含量達(dá)到其生存水體中七氯含量的200～37 000 倍。另外，關(guān)于七氯相關(guān)化合物的研究可能涉及多種機(jī)制，但這些化合物的共同特點(diǎn)是性質(zhì)穩(wěn)定且不易降解，可以通過(guò)食物鏈積累生物從而進(jìn)入人體，尤其是部分乳制品被認(rèn)為是人類接觸農(nóng)藥的主要來(lái)源[9-10]，長(zhǎng)期使用可能會(huì)導(dǎo)致人腦黑質(zhì)中DA 神經(jīng)元的損害，故被認(rèn)為一直與PD 的病理機(jī)制有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)將首次嘗試用七氯制備PD模型，以期為PD的病因和發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取的成年野生型AB 斑馬魚(yú)（zebrafish）飼養(yǎng)于福州百維斯生物科技有限公司斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，將雌雄斑馬魚(yú)分別飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)溫度28 ℃、光照14 h、黑暗10 h的環(huán)境下，并于每天上午9點(diǎn)和下午5 點(diǎn)喂食2 次鹽水蝦。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究屬于低等動(dòng)物，是在充分的動(dòng)物護(hù)理和使用指南下進(jìn)行的，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 藥品、試劑及儀器

七氯溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，H298702-1 mL）；6-羥基多巴胺（6-OHDA）（上海源葉生物科技有限公司，S30042-100 mg）；1X E3培養(yǎng)液（福州百維斯生物科技有限公司自制，60X E3培養(yǎng)液配制方法：NaCl 344 mg、KCl 15.2 mg、CaCl2·2H2O 58 mg、MgSO4·7H2O 98 mg，溶于60μL 0.01%的亞甲藍(lán)中，定容至20 mL）；三卡因甲基磺酸鹽（美國(guó)Sigma 公司，MS-222）；甲基纖維素（上海索萊寶生物科技有限公司，M8070）；trizol RNA 分離試劑盒（中國(guó)南京Vazyme 公司，R401-01）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)南京Vazyme 公司，R123-01）；熒光定量PCR 試劑盒（中國(guó)南京Vazyme 公司，Q311-02）；斑馬魚(yú)飼養(yǎng)養(yǎng)殖系統(tǒng)（福州百維斯生物科技有限公司）；光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，THZ-100）；一體式熒光顯微鏡（尼康，SMZ800N）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（東勝興業(yè)，ETC811）；4 ℃離心機(jī)（Scilogex）；qPCR儀（Archimed）。

1.3 動(dòng)物處理

當(dāng)次日需使用卵時(shí)，于前一天下午4～5點(diǎn)左右，將體型正常且性成熟的斑馬魚(yú)以1∶1或1∶2的雌雄比例放入裝有胚培養(yǎng)水的玻璃缸中，并用白色透明隔板隔開(kāi)。次日上午9 時(shí)，取出隔板，進(jìn)行交配產(chǎn)卵，在5 h 后分缸收集胚胎。先將胚胎用胚培養(yǎng)水清洗3次，然后收集到干凈且無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，同時(shí)利用解剖顯微鏡挑選優(yōu)質(zhì)胚胎，選出發(fā)育正常至囊胚期的胚胎，每孔30枚，放于6孔板中，然后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、750 μmol/L 6-OHDA 組和七氯組。關(guān)于七氯殺蟲(chóng)劑對(duì)人體的有害劑量，有研究[11]通過(guò)食用安全性分析為0.5μg/kg·d-1。根據(jù)人-斑馬魚(yú)體表面積比，換算后設(shè)計(jì)七氯溶液劑量范圍為0.08～1 mg/L。在0.08～1 mg/L 劑量范圍對(duì)藥物濃度最佳劑量進(jìn)行探索，培養(yǎng)體系為4 mL，設(shè)置5 個(gè)濃度梯度即每孔分別為1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL七氯組，每孔設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔取均值。每天給藥1 次，統(tǒng)計(jì)并丟棄死卵，連續(xù)5 d，將給藥后的胚胎放于28 ℃恒溫光控培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)曝光120 h。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 斑馬魚(yú)死亡率、畸形率和形態(tài)學(xué)的檢測(cè)

斑馬魚(yú)發(fā)育情況可以通過(guò)是否畸形和形體異常來(lái)體現(xiàn)。先鏡下觀察幼體心臟有無(wú)跳動(dòng)和形體是否發(fā)黑，若心臟停止跳動(dòng)和形體已發(fā)黑，則確認(rèn)死亡。每24 h 記錄不同濃度下斑馬魚(yú)胚胎死亡和畸形的數(shù)目，計(jì)算幼體累積死亡率（24～120 hpf）和畸形率（24～120 hpf）。

每組隨機(jī)選取10 條魚(yú)，用濃度為40 mg/L 三卡因?qū)⒂紫x(chóng)麻醉，后加入纖維素固形，然后鏡下觀察并拍攝形體異常改變，包括心包水腫、卵黃囊吸收延遲、弓背彎曲、魚(yú)鰾有無(wú)缺失、體長(zhǎng)有無(wú)縮短等。

1.4.2 斑馬魚(yú)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

收集各組120 h 后的幼魚(yú)，進(jìn)行觸尾實(shí)驗(yàn)。先在胚培養(yǎng)水中清洗3 次，然后在常規(guī)白色泡沫盒中裝少許胚培養(yǎng)水。每組隨機(jī)選取1條幼魚(yú)置于胚培養(yǎng)水中，將泡沫盒底部作為記錄區(qū)域，確保每條斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)區(qū)域都在該區(qū)域內(nèi)，讓斑馬魚(yú)適應(yīng)2～3 min后，將針插在幼魚(yú)尾部停留的位置，隨后用另一根針刺激幼魚(yú)的尾部進(jìn)行行為追蹤，直到幼魚(yú)停止游動(dòng)后，立即將針插在尾部，進(jìn)行3次重復(fù)。用標(biāo)尺測(cè)量各組幼魚(yú)游動(dòng)的直線距離，記錄每次數(shù)據(jù)。

1.4.3 斑馬魚(yú)凍存方法

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集各組120 h 后的幼魚(yú)。先用蒸餾水清洗3次，后分組裝入1.5 mL EP管中，并用針管將EP 管中的水吸干，然后在每管中加入500 μL trizol，將樣品放于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存，以防止RNA降解，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)斑馬魚(yú)DA神經(jīng)元相關(guān)基因表達(dá)

從-80 ℃冰箱中取出120 hpf 下的幼魚(yú)，按照組織總分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品總RNA。將各組RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)設(shè)置：第一步50 ℃，15 min，第二步85 ℃，2 min，得到的產(chǎn)物cDNA作為RT-qPCR 模板可立即用于qPCR SYBR Green Master Mix。擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)置：第一階段：預(yù)變性，95 ℃，30 s，1 個(gè)循環(huán)；第二階段：循環(huán)反應(yīng)：95 ℃，10 s,60 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)；第三階段：融解曲線：95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s，1 個(gè)循環(huán)，并收集退火后的熒光信號(hào)。每個(gè)樣品設(shè)計(jì)3 個(gè)復(fù)孔，利用公式2-△△CT計(jì)算得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。

表1 PCR引物的序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0 軟件對(duì)記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行作圖。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD 法；方差不齊則采用Games-Howell 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組斑馬魚(yú)死亡率、畸形率及發(fā)育形態(tài)改變情況

與正常對(duì)照組比較，在24～120 hpf 時(shí)，6-OHDA組死亡率升高（P＜0.05），1～100 ng/mL 七氯組死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），1 000～10 000 ng/mL 七氯組死亡率升高（P＜0.05）；與6-OHDA 組比較，在24～120 hpf 時(shí)，1～1 000 ng/mL 七氯組死亡率降低，但10 000 ng/mL 七氯組死亡率升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。

與正常對(duì)照組比較，在72～120 hpf 時(shí)，6-OHDA組畸形率升高（P＜0.05），1～100 ng/mL 七氯組畸形率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），1 000～10 000 ng/mL 七氯組畸形率升高（P＜0.05）；與6-OHDA 組比較，在72～120 hpf 時(shí)，1～1 000 ng/mL 七氯組畸形率降低，但10 000 ng/mL 七氯組畸形率升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 各組斑馬魚(yú)胚胎生長(zhǎng)情況的比較

正常對(duì)照組（單體和群體）斑馬魚(yú)器官發(fā)育正常且體長(zhǎng)清晰可見(jiàn)。與正常對(duì)照組比較，在24～48 hpf 時(shí)，6-OHDA組和1～10 000 ng/mL七氯組幼體均無(wú)明顯變化；在72～120 hpf 時(shí)，6-OHDA組幼體出現(xiàn)色素分布不均勻和脊柱彎曲，1～100 ng/mL 七氯組幼體無(wú)明顯變化，1 000～10 000 ng/mL 七氯組幼體出現(xiàn)色素沉著分布和脊柱彎曲，10 000 ng/mL 七氯組幼體還出現(xiàn)心包水腫、邊界模糊、體長(zhǎng)縮短、脊柱重度彎曲畸形，甚至造成死亡，見(jiàn)圖2A、圖2B。

圖2 各組斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育情況的比較

2.2 各組斑馬魚(yú)行為學(xué)觀察比較的影響

與正常對(duì)照組比較，6-OHDA 組運(yùn)動(dòng)距離縮短（P＜0.05），1～10 000 ng/mL 七氯組運(yùn)動(dòng)距離縮短（P＜0.05）；與6-OHDA組比較，1～100 ng/mL七氯組運(yùn)動(dòng)距離無(wú)明顯變化，1 000～10 000 ng/mL 七氯組運(yùn)動(dòng)距離更短，其中10 000 ng/mL 七氯組運(yùn)動(dòng)距離縮短（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。

2.3 各組斑馬魚(yú)多巴胺神經(jīng)元相關(guān)基因表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，6-OHDA 組TH2基因表達(dá)降低（P＜0.05），1～10 000 ng/mL七氯組TH2基因表達(dá)降低（P＜0.05）；與6-OHDA組比較，1 000-10 000 ng/mL 七氯組TH2基因表達(dá)更低，10 000 ng/mL 七氯組TH2基因表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

圖3 各組行為學(xué)和TH2基因表達(dá)的比較

3 討論

近年來(lái)，6-OHDA藥物作為PD的傳統(tǒng)模型已被廣泛應(yīng)用，但該模型缺點(diǎn)是不能穿過(guò)血腦屏障[12]，故而選擇合適的注射部位是此模型成功的關(guān)鍵。目前，斑馬魚(yú)作為一種常用的神經(jīng)科學(xué)模式生物，具有與人類相似的神經(jīng)發(fā)育等特點(diǎn)，且無(wú)需解剖便可觀察各器官發(fā)育情況[13-14]。同時(shí)斑馬魚(yú)中的基因序列與人腦的基因序列相似度極高[15]。因此，本研究設(shè)計(jì)在斑馬魚(yú)玻璃缸水體中加入已制備完全的七氯溶液來(lái)建立斑馬魚(yú)PD 動(dòng)物模型，通過(guò)從形態(tài)學(xué)和行為學(xué)方面觀察比較，發(fā)現(xiàn)可以較好地表現(xiàn)出人類PD 患者的部分臨床癥狀。另外，與傳統(tǒng)模型相比，該方法死亡率較低，操作簡(jiǎn)單便捷，建模周期短，且后期指標(biāo)檢測(cè)取材方便等優(yōu)勢(shì)，也為未來(lái)PD藥物的篩選提供了快速而有效的研究手段。

七氯屬于環(huán)二烯類殺蟲(chóng)劑，可以促進(jìn)大鼠腦細(xì)胞內(nèi)DA神經(jīng)元中α-突觸核蛋白過(guò)度表達(dá)從而形成胞內(nèi)包涵體[16]。研究表明，接觸七氯幾小時(shí)后，體內(nèi)大約20%的七氯就會(huì)降解為環(huán)氧化七氯，這些化合物會(huì)對(duì)DA系統(tǒng)造成破壞[17]。同時(shí)，毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)，一些殺蟲(chóng)劑如氨基甲酸酯、有機(jī)氯和有機(jī)磷酸酯等類物質(zhì)，會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，即誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、α-突觸核蛋白原纖維化、神經(jīng)元細(xì)胞丟失，進(jìn)而逐漸走向細(xì)胞凋亡，這些病理改變?cè)谝欢ǔ潭壬嫌兄赑D的發(fā)生和發(fā)展[18-19]。Meta 分析顯示，接觸除草劑、有機(jī)磷農(nóng)藥等物質(zhì)也是PD 發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，他們廣泛存在于環(huán)境中，能夠選擇性破壞黑質(zhì)—紋狀體通路中的DA 受體，抑制腺苷三磷酸（ATP）的合成，增加氧化反應(yīng)的生成[20]，最終引發(fā)PD樣病變。

本研究嘗試用七氯誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)PD 模型，出現(xiàn)了幼體死亡、發(fā)育形態(tài)畸形、行為動(dòng)作緩慢和TH2 基因表達(dá)異常等改變，說(shuō)明斑馬魚(yú)PD 模型建立成功。隨著藥物濃度的升高，七氯組不僅抑制了斑馬魚(yú)發(fā)育能力，讓幼蟲(chóng)的病死數(shù)量逐漸增加，而且誘發(fā)了體型異常，出現(xiàn)心包腫大、魚(yú)鰾缺損、脊柱嚴(yán)重畸形、體長(zhǎng)縮短等情況，提示七氯可影響斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)。行為學(xué)顯示，七氯組斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)能力下降，速度減慢，運(yùn)動(dòng)距離縮短，產(chǎn)生的神經(jīng)毒性效應(yīng)要比6-OHDA 組更明顯，表明PD 斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)障礙。TH2 參與DA 合成，其表達(dá)水平與腦內(nèi)DA 含量呈正相關(guān)關(guān)系，因此將TH2 含量的表達(dá)作為驗(yàn)證PD 模型是否成功的關(guān)鍵[21]。經(jīng)七氯造模后，TH2 的表達(dá)水平下降，提示七氯影響了腦內(nèi)DA的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前研究基因表達(dá)趨勢(shì)相同且相關(guān)指標(biāo)變化符合PD 特征，證實(shí)了一種新的可替代傳統(tǒng)方法的斑馬魚(yú)PD 模型建立的成功。同時(shí)，突出了殺蟲(chóng)劑七氯在誘導(dǎo)PD 發(fā)病中的毒素作用，為七氯的毒理學(xué)研究和PD 的臨床治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究證實(shí)了1 000～10 000 ng/mL濃度的七氯溶液最適合建立斑馬魚(yú)PD 模型，而且當(dāng)濃度為10 000 ng/mL 時(shí)，斑馬魚(yú)表型改變及TH2基因表達(dá)變化顯著，其效果與傳統(tǒng)造模試劑6-OHDA 類似，認(rèn)為是一種PD 造模的合理方法。另外，斑馬魚(yú)遺傳操作方便、周期短、產(chǎn)卵多、易飼養(yǎng)，故取培養(yǎng)時(shí)間1周為宜。