張 瑞，羅 彬，劉安貴，周圣圣，彭志剛，馬 劼

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南寧 530021）

彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤最常見的亞型，約占非霍奇金淋巴瘤的30%[1]。目前，利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強(qiáng)的松（R-CHOP）被認(rèn)為是改善DLBCL患者預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案，明顯提升了患者的10年總生存期。然而，仍有部分接受R-CHOP方案治療的患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)。30%～50%對R-CHOP有原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥的患者的生存預(yù)后明顯較差，中位總生存期僅約6.3 個(gè)月[2-3]。目前已有R-CHOP耐藥的相關(guān)研究[4]，但耐藥機(jī)制仍未完全闡明。

阿霉素廣泛用于人類多種惡性腫瘤的治療，對各個(gè)細(xì)胞周期的腫瘤細(xì)胞均有殺滅作用。臨床上用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤等[5]。在DLBCL，阿霉素是R-CHOP 方案的重要組成部分。因此，研究DLBCL 對阿霉素的耐藥機(jī)制具有重要的臨床意義。為了系統(tǒng)地研究DLBCL 中阿霉素的耐藥機(jī)制，本研究在DLBCL細(xì)胞系中進(jìn)行了測序分析，這些細(xì)胞系在長期暴露后獲得了對阿霉素的耐藥性。通過對耐藥相關(guān)的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳的綜合分析，初步揭示與DLBCL 耐藥相關(guān)的信號通路和關(guān)鍵調(diào)控因子。

1 材料與方法

1.1 阿霉素耐藥細(xì)胞株的培養(yǎng)及測序分析 DLBCL耐阿霉素細(xì)胞株是通過對阿霉素敏感的DLBCL細(xì)胞系在阿霉素低濃度梯度遞增培養(yǎng)法誘導(dǎo)產(chǎn)生的[6]。取對數(shù)生長期的DLBCL細(xì)胞，分別加入阿霉素（濃度為0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.04 μmol/L、0.06 μmol/L、0.08 μmol/L、0.10 μmol/L、0.12 μmol/L），誘導(dǎo)7 個(gè)月，最終得到耐藥細(xì)胞株。使用0.08 μmol/L阿霉素分別處理耐藥細(xì)胞株和對照組細(xì)胞，對照組細(xì)胞包含兩種情況，即不加任何干預(yù)的敏感細(xì)胞系和0.5%DMSO 干預(yù)的細(xì)胞系對照。分別于24 h、48 h、72 h檢測阿霉素對DLBCL細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株形態(tài)、增殖、凋亡的影響，耐藥細(xì)胞在阿霉素刺激下，其細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡指標(biāo)等與對照組DLBCL細(xì)胞比較均無明顯差異，則說明阿霉素耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。分別對阿霉素耐藥細(xì)胞株和阿霉素敏感細(xì)胞株進(jìn)行測序分析。通過耐阿霉素細(xì)胞和親本細(xì)胞測序，獲得基因表達(dá)矩陣，使用DEseq2 包進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|≥1且P＜0.05，獲得的差異基因被認(rèn)為是潛在的耐藥相關(guān)基因。

1.2 公共數(shù)據(jù)集的獲取 在GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中篩選DLBCL相關(guān)的數(shù)據(jù)集，檢索式為Diffuse large B cell lymphoma OR DLBCL。納入條件：（1）研究僅針對人類；（2）提供的樣本包含DLBCL 組織和正常淋巴組織，且樣本量＞3；（3）能獲取原始表達(dá)數(shù)據(jù)或表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)?；?于TCGA 和Genotype-Tissue Expression（GTEx）數(shù)據(jù)評估耐藥相關(guān)基因在DLBCL 中的表達(dá)水平。將提供生存狀態(tài)及生存時(shí)間的數(shù)據(jù)集單獨(dú)篩選出來，用于評估耐藥相關(guān)基因與DLBCL 患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 信號通路分析 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）是一個(gè)常用的信號通路分析網(wǎng)站，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)GO和KEGG分析。GO分析包括分子功能、生物學(xué)過程及細(xì)胞組分分析。KEGG分析用于注釋一系列基因涉及的代謝通路。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)算GEO 數(shù)據(jù)庫獲得的表達(dá)數(shù)據(jù)，用于評估耐藥相關(guān)基因在DLBCL中的表達(dá)；Stata 12.0 用于合并每個(gè)GEO 數(shù)據(jù)集的結(jié)果。采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行生存分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤阿霉素耐藥相關(guān)基因的識(shí)別 經(jīng)過測序分析，獲得耐藥細(xì)胞株和不耐藥細(xì)胞株的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析獲得耐藥細(xì)胞組和非耐藥細(xì)胞組之間的差異基因，這些基因在阿霉素耐藥發(fā)生過程中失調(diào)，被認(rèn)為可能是阿霉素耐藥相關(guān)基因。通過分析未經(jīng)處理的親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中生成的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)相對于未經(jīng)處理的親代細(xì)胞，耐藥細(xì)胞中有2 186個(gè)上調(diào)基因和725個(gè)下調(diào)基因；通過分析經(jīng)過0.5%DMSO 處理的親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中生成的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)相對于0.5%DMSO處理的親代細(xì)胞，耐藥細(xì)胞中有1 494個(gè)上調(diào)基因和210個(gè)下調(diào)基因；分別將上調(diào)的基因進(jìn)行交集，最后共獲得900個(gè)上調(diào)基因，見圖1。

圖1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤阿霉素耐藥相關(guān)基因的鑒定

2.2 淋巴瘤阿霉素耐藥相關(guān)信號通路分析 本研究對通過測序數(shù)據(jù)計(jì)算得到的900個(gè)耐藥相關(guān)基因進(jìn)行信號通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt、細(xì)胞黏附分子（Cell adhesion molecules，CAMs）等信號通路顯著富集。這些信號通路與腫瘤耐藥相關(guān)[7-9]。其中PI3K-Akt 信號通路在多篇文獻(xiàn)中被報(bào)道與DLBCL R-CHOP耐藥相關(guān)[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)有25個(gè)基因富集在這條通路中，包括FLT1、ITGB5、LAMC3、LAMA3、ITGA2B、JAK3、PCK2、ANGPT4、LAMB3、ITGA1、PPP2R3A、NGF、VEGFA、COL1A1、COL2A1、COL5A1、PPP2R2B、IL2RA、KIT、IL2RB、ITGA7、ITGA6、SGK1、EPHA2、CREB5，見圖2。

圖2 富集在PI3K-Akt信號通路中的基因

2.3 調(diào)控耐藥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 為了闡釋調(diào)控阿霉素耐藥的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，KnockTF（http://www.licpathway.net/KnockTF/）被用來預(yù)測可能調(diào)控900個(gè)耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子，取P＜0.05 作為納入的條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共223 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控耐藥相關(guān)基因，其中排在前5 名的是FOXM1、TP63、FOXP1、NR2F2、PTBP1，見表1。預(yù)測調(diào)控富集在PI3K-Akt信號通路中的25個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)共有169 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控這些基因，其中排在前5 名的是TP53、FOXM1、MITF、PTBP1、TP63，見表2。FOXM1、TP63、PTBP1 可能通過PI3K-Akt 信號通路參與調(diào)控DLBCL阿霉素耐藥的發(fā)生，見圖3。

圖3 調(diào)控阿霉素耐藥的潛在轉(zhuǎn)錄因子

表1 參與調(diào)控阿霉素耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子

表2 調(diào)控富集在PI3K-Ak信號通路中的基因的轉(zhuǎn)錄因子

2.4 FOXM1 為調(diào)控DLBCL 阿霉素耐藥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 通過STRING評估3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否存在相互調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不存在相互調(diào)控，提示FOXM1、TP63、PTBP1 可能獨(dú)立調(diào)控阿霉素耐藥產(chǎn)生（圖4A）?；贕EO數(shù)據(jù)庫，評估FOXM1、TP63、PTBP1 在DLBCL 中的表達(dá)水平。本研究共納入6個(gè)數(shù)據(jù)集，包括GSE9327、GSE12195、GSE23647、GSE25638、GSE32018、GSE43677。納入的數(shù)據(jù)集均包含DLBCL 樣本和正常樣本的基因表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXM1和PTBP1在DLBCL中呈高表達(dá)（圖4B、圖4C、圖4D）。

圖4 評估阿霉素耐藥的潛在轉(zhuǎn)錄因子在DLBCL中的表達(dá)水平

進(jìn)一步評估FOXM1 和PTBP1 是否與DLBCL患者的生存密切相關(guān)，共基于6 個(gè)數(shù)據(jù)集分別計(jì)算FOXM1和PTBP1在DLBCL中的風(fēng)險(xiǎn)值，這些數(shù)據(jù)集包括GSE10846、GSE21846、GSE32918、GSE34171、GSE53786、GSE57611。Meta 分析合并了HR值，發(fā)現(xiàn)FOXM1 與DLBCL 預(yù)后不良密切相關(guān)，見圖5。FOXM1 在耐藥細(xì)胞株中無差異表達(dá)，由此推測，F(xiàn)OXM1可能并不是通過自身表達(dá)的失調(diào)來調(diào)控耐藥基因的表達(dá)，從而介導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生。

圖5 FOXM1與DLBCL患者總生存率的關(guān)系

2.5 FOXM1 通過PI3K-Akt 信號通路調(diào)控阿霉素耐藥的產(chǎn)生 基于以上研究，初步推測FOXM1 可能是通過PI3K-Akt 信號通路調(diào)控阿霉素耐藥的產(chǎn)生。分析FOXM1 shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染24 h 的伯基特淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)譜和使用非靶標(biāo)對照shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染24 h的伯基特淋巴瘤細(xì)胞的表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)OXM1 后，有712 個(gè)基因發(fā)生了表達(dá)變化，通過信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些基因顯著的富集在PI3K-Akt 信號通路中。因此，沉默F(xiàn)OXM1 后會(huì)影響PI3K-Akt信號通路通路的作用，見圖6A、圖6B。

2.6 FOXM1 靶基因的鑒定 為了進(jìn)一步明確FOXM1 在介導(dǎo)阿霉素耐藥過程中的潛在靶標(biāo)，將900 個(gè)耐藥相關(guān)基因和沉默F(xiàn)OXM1 后表達(dá)顯著改變的711 個(gè)基因取交集，最終獲得31 個(gè)交集基因，包括TXK、CLCA1、GPR18、LSR、VCAN、RTN1、CD52、NDRG1、PPFIA4、IRF5、CD37、PLAU、SRGN、SCNN1A、CTH、LHFPL2、PLA2G1B、RPS6KA2、SEMG1、F13A1、COLGALT2、PTGES、OPTN、SORBS1、ITGA6、SLC18A2、TPM2、ABCG2、PTPRD、ASNS、SLC16A2。其中ITGA6 是唯一位于PI3K-Akt 信號通路中的基因，且與FOXM1 呈正相關(guān)關(guān)系，見圖6C、圖6D。據(jù)此推測ITGA6是FOXM1在調(diào)控阿霉素耐藥中的靶基因。

圖6 FOXM1靶基因的探索

3 討論

由于DLBCL本身的高異質(zhì)性，即使60%～70%的患者可以在一線治療中獲益，但仍有不少患者出現(xiàn)治療耐藥。目前報(bào)道的耐藥機(jī)制主要包括3種觀點(diǎn)。第一，DLBCL 是一種高度異質(zhì)性的疾病，患者間和患者內(nèi)的腫瘤異質(zhì)性包含各種遺傳或表觀遺傳修飾，在治療之前或期間獲得的這種空間和時(shí)間多樣性導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生；第二，腫瘤微環(huán)境中的浸潤性免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過改變腫瘤免疫環(huán)境和防止細(xì)胞凋亡，在介導(dǎo)治療耐藥性方面發(fā)揮重要作用；第三，宿主特異性因素導(dǎo)致的不同個(gè)體患者之間的差異引起高度可變的治療反應(yīng)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，R-CHOP 中的5 種藥物具有非常低的交叉耐藥性，說明這5 種藥物的耐藥機(jī)制可能并不一致。有研究通過這些藥物長期干預(yù)獲得RCHOP耐藥的DLBCL細(xì)胞系，在這些細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SOX2 的上調(diào)，并且通過PI3K/AKT通路介導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑聯(lián)合R-CHOP能顯著延長攜帶這些抗性細(xì)胞小鼠的存活時(shí)間[10]。質(zhì)譜成像揭示了耐藥的DLBCL中脂質(zhì)和代謝譜的分子特征，在耐藥樣品中鑒定出更高水平的磷脂酰肌醇和鞘磷脂片段以及減少的三磷酸腺苷和增加的單磷酸腺苷[14]。

本研究重點(diǎn)關(guān)注阿霉素耐藥相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建了DLBCL阿霉素耐藥的細(xì)胞模型，通過測序分析鑒定出阿霉素耐藥相關(guān)的基因，并對這些基因進(jìn)行信號通路分析，發(fā)現(xiàn)這些耐藥基因主要在PI3K-AKT 通路中顯著富集。據(jù)此推測PI3K-AKT通路是阿霉素耐藥涉及的關(guān)鍵信號通路。轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析發(fā)現(xiàn)FOXM1可以調(diào)控68.3%的耐藥基因，提示FOXM1在介導(dǎo)阿霉素耐藥過程中重要作用。為了證明FOXM1 是否是通過影響PI3K-AKT 通路介導(dǎo)阿霉素耐藥的產(chǎn)生，本研究也探索了調(diào)控富集在PI3K-AKT 通路中的基因的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXM1 仍然是處于顯著地位的。此外，在非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞中沉默F(xiàn)OXM1 的表達(dá)，在沉默F(xiàn)OXM1 的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)了廣泛的基因表達(dá)異常，信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在PI3K-AKT通路中，由此認(rèn)為FOXM1是通過影響PI3K-AKT通路介導(dǎo)阿霉素耐藥的產(chǎn)生。

FOXM1 是參與細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄激活因子。在人類惡性腫瘤中，F(xiàn)OXM1 與耐藥的關(guān)系被廣泛的報(bào)道[15-16]。研究表明，F(xiàn)OXM1在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與胃癌患者對紫杉醇和順鉑的耐藥性相關(guān)[17]。FOXM1 通過上調(diào)NUF2 表達(dá)干擾PI3KAKT-mTOR信號通路，調(diào)節(jié)自噬使膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性[18]。在肺癌中，F(xiàn)OXM1變異通過激活非小細(xì)胞肺癌wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致吉非替尼耐藥。FOXM1 通過調(diào)控ABCC5 基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞耐藥[19]。在DLBCL中，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道FOXM1與R-CHOP方案耐藥有關(guān)。本研究首次提出FOXM1在介導(dǎo)DLBCL耐藥中的關(guān)鍵作用，將為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。涉及耐藥相關(guān)的信號通路也有廣泛的報(bào)道，其中PI3K-AKT 通路在多種人類腫瘤中被報(bào)道與耐藥有關(guān)。例如，HIF-1α調(diào)節(jié)的stanniocalcin-1 通過PI3K-AKT 信號通路介導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌對吉西他濱的耐藥性[20]。姜黃提取物通過TLR4-PI3K-Akt-mTOR 通路逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性[21]。敲低CXCR4 通過PI3K-Akt-mTOR 通路增強(qiáng)紫杉醇在卵巢癌中的敏感性[22]。C2orf40 通過影響細(xì)胞周期和激活PI3KAKT-mTOR 信號通路抑制轉(zhuǎn)移并調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的化療耐藥和放療耐藥[23]。

綜上所述，PI3K-AKT 通路是參與腫瘤耐藥的關(guān)鍵信號通路，F(xiàn)OXM1可能通過影響PI3K-AKT通路介導(dǎo)阿霉素耐藥的產(chǎn)生。本研究仍然存在不足：第一，尚且缺乏更深入的體內(nèi)、體外試驗(yàn)證明FOXM1 在DLBCL 耐藥中的重要作用；第二，本研究采用其他非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系的數(shù)據(jù)研究沉默F(xiàn)OXM1后基因表達(dá)變化情況，代表性存在不足。