陳 芳，溫 艷，姜小帆

（1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，西安 710000；2.陜西省人民醫(yī)院，西安 710068）

靈芝（Ganoderma lucidum）為多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體［1，2］，又名赤芝、紅芝、丹芝、瑞草，外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形［3-5］。在中國(guó)普遍分布，歐洲、美洲、非洲、亞洲東部也有不同量產(chǎn)［6-8］。其富含氨基酸、多肽、麥角甾醇、三萜類、黃酮等功能活性成分，從而具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、抗氧化、延緩衰老等臨床藥效作用［9-13］。研究發(fā)現(xiàn)黃酮化合物是指以2-苯基苯并吡喃酮為母核的一大類天然化合物及其衍生物［14-16］。超聲波輔助提取法主要是利用其空化作用破壞植物細(xì)胞使提取物溶入提取液中，進(jìn)而提高了提取效率，是一種操作簡(jiǎn)單、便捷、能耗低的生物活性物質(zhì)提取新方法［17，18］。目前，對(duì)植物體內(nèi)黃酮類化合物提取研究報(bào)道較多［19-21］。然而，利用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化超聲輔助提取技術(shù)有效地提高靈芝中黃酮提取率的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用超聲輔助法提取靈芝中的黃酮，以提取溶劑乙醇濃度、料液比、浸提功率及浸提時(shí)間為考察因素，通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化其最優(yōu)工藝提取條件。篩選出最優(yōu)提取方法，提高靈芝的綜合利用率，降低靈芝黃酮的提取成本，為工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：市售，產(chǎn)地長(zhǎng)白山，將靈芝切成碎片后用研磨儀粉碎后備用。

水為GB/T 6682—2008 規(guī)定的一級(jí)水，由陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院制備；硝酸鋁、乙酸鉀、氫氧化鈉等（均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），濟(jì)南潤(rùn)泰化工股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%，生產(chǎn)批號(hào)：C100001），北京輝光科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CLN-24L 型低溫組織研磨儀、UV-2601 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京紅凱瑞利分析儀器有限公司；80目標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩，上海過(guò)望化工有限公司；SCQ-1800F型超聲波提取儀，上海鴻運(yùn)儀器股份有限公司；H2500R-2 型高速冷凍離心機(jī)，廣東祥高實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；WB-502S 型超級(jí)電熱恒溫水浴鍋，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；OE-45 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津瑞捷科技有限公司；Research plus 單道移液器，Eppendorf中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靈芝黃酮的提取 稱取靈芝粉末2.0 g（精確至0.001 g）置于150 mL 具塞三角瓶中，用75%～95%的乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶（5～25）g/mL 加入提取溶劑，在超聲功率為120～200 W 的條件下提取10～50 min，儀器工作頻率為40 kHz，提取液以4 500 r/min 離心10 min，取其上清液，按照相同條件繼續(xù)提取1 次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸餾儀濃縮至1 mL，過(guò)C18SPE 小柱進(jìn)行脫色處理，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，得到靈芝黃酮的提取液，待測(cè)。

1.3.2 蘆丁工作曲線的制作 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50 mg（精確至 0.001 mg）于 50 mL 容量瓶中，加入20 mL 無(wú)水乙醇超聲溶解后并用無(wú)水乙醇定容至刻度，即得1.0 mg/mL 貯備液，放于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

精密吸取蘆丁貯備液 1、2、3、4、5 mL 分別置于50 mL 容量瓶中，加無(wú)水乙醇至總體積為15 mL，依次加入質(zhì)量濃度為100 g/L 的硝酸鋁溶液、98 g/L 的乙酸鉀溶液各1 mL；搖勻后加水至刻度，再次搖勻；靜置60 min，用1 cm 比色皿于420 nm 處測(cè)定吸光度，以30%乙醇溶液為空白；以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=1.457 8x+0.065 78，R2=0.999 8。

1.3.3 靈芝黃酮的測(cè)定 精密吸取待測(cè)樣品溶液1.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，按照“1.3.2”進(jìn)行顯色反應(yīng)后測(cè)定，其計(jì)算公式為：

式中，X為黃酮類化合物的總含量（%）；m為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求出樣品比色液中的蘆丁質(zhì)量（mg）；W為樣品的質(zhì)量（g）；d為稀釋比例。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 按照“1.3.1”的方法提取靈芝黃酮，提取條件為固定料液比1∶20（g/mL）、提取功率180 W、提取時(shí)間30 min，考察不同乙醇濃度（75%、80%、85%、90%、95%）對(duì)靈芝黃酮得率的影響；固定提取溶劑為90%乙醇、提取功率180 W、提取時(shí)間30 min，考察不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL）對(duì)靈芝黃酮得率的影響；固定提取溶劑為90%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間30 min，考察不同提取功率（120、140、160、180、200 W）對(duì)靈芝黃酮得率的影響；固定提取溶劑為90%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取功率180 W，考察不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)靈芝黃酮得率的影響。

1.3.5 靈芝黃酮超聲波提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 選取浸提溶劑乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸提功率（C）、浸提時(shí)間（D）為自變量，以靈芝黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)原理做4 因素3 水平曲面設(shè)計(jì)，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及模型建立，對(duì)超聲波輔助提取靈芝黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)靈芝黃酮得率的影響 由圖1 可知，當(dāng)乙醇濃度為75%～90%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加靈芝黃酮的提取得率逐漸增大；當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，靈芝黃酮的提取得率達(dá)到最大值；當(dāng)乙醇濃度大于90%時(shí)，靈芝黃酮的提取得率隨著提取溶劑濃度的增加反而逐漸降低。其原因可能是乙醇濃度為90%時(shí)，靈芝黃酮的溶出趨于飽和，隨著乙醇濃度的增加，其他醇溶性色素、親脂溶性物質(zhì)溶出增多，這類物質(zhì)與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)同乙醇-水分子結(jié)合，從而使得靈芝黃酮得率降低。因此選擇乙醇濃度為85%、90%、95%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 提取溶劑濃度對(duì)靈芝黃酮得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)靈芝黃酮得率的影響 由圖2 可知，當(dāng)料液比為 1∶（5～20）g/mL 時(shí)，隨著提取溶劑的增加靈芝黃酮的提取率急劇增加，其原因可能是隨著提取溶劑的增加，增大了靈芝樣品與提取溶劑的接觸面積，有利于靈芝黃酮的溶出，故黃酮提取得率急劇增加；隨著提取溶劑的繼續(xù)增加靈芝黃酮的提取率趨于平緩增長(zhǎng)，其原因可能是靈芝黃酮的溶出逐漸趨于平穩(wěn)，且大部分已溶入提取溶劑中，繼續(xù)增加提取溶劑會(huì)造成其他雜質(zhì)的溶出，而且還會(huì)造成提取成本的上升。因此選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)靈芝黃酮得率的影響

2.1.3 提取功率對(duì)靈芝黃酮得率的影響 由圖3 可知，當(dāng)超聲波提取功率小于180 W 時(shí)，隨著提取功率增大靈芝黃酮的提取得率逐漸增大；當(dāng)提取功率為180 W 時(shí)，靈芝黃酮提取得率達(dá)到最大值；當(dāng)提取功率大于180 W 時(shí)，靈芝黃酮的提取得率逐漸下降，其原因可能是超聲功率達(dá)到一定強(qiáng)度可以產(chǎn)生更好的空化效果，但功率過(guò)大可能會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。因此提取功率選擇160、180、200 W 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 提取功率對(duì)靈芝黃酮得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)靈芝黃酮得率的影響 由圖4 可知，當(dāng)提取時(shí)間為10～30 min 時(shí)，靈芝黃酮的提取得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而上升；并在提取時(shí)間為30 min 時(shí)靈芝黃酮提取得率達(dá)到最大值；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min 時(shí)，繼續(xù)增加提取時(shí)間，靈芝黃酮的提取得率隨著提取時(shí)間增加而降低。其原因可能是提取時(shí)間為30 min 時(shí)，靈芝黃酮已基本完全溶出，繼續(xù)增加提取時(shí)間反而會(huì)使其他物質(zhì)溶出。同時(shí)，樣品處于長(zhǎng)時(shí)間的超聲中，會(huì)導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被分解，造成黃酮提取得率降低。因此選擇提取時(shí)間為20、30、40 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)靈芝黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面法分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理［22-24］，以提取溶劑乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸提功率（C）和浸提時(shí)間（D）4 個(gè)因素為自變量，以靈芝黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行4 因素3 水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到四元二次回歸方程：Y=68.78+0.25A+0.39B-0.65C-0.21D+0.55AB-0.75AC-0.49AD-0.64BC-0.65BD+0.45CD-0.35A2+1.35B2-0.16C2-1.57D2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

2.2.2 方差分析 由表3 方差分析可知，P模型＜0.000 1，表明回歸模型具有高度顯著性；P失擬值=0.915＞0.05，失擬值不顯著說(shuō)明模型構(gòu)建成功，表明試驗(yàn)以外的其他因素對(duì)本試驗(yàn)黃酮提取得率影響較?。煌ㄟ^(guò)判定系數(shù)（R2=0.985）可評(píng)價(jià)回歸模型的擬合程度，其值越接近1，表明回歸方程的擬合度越好［25］。根據(jù)F的大小可知4 個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)黃酮得率影響的主次順序依次為提取溶劑乙醇濃度（A）＞浸提功率（C）＞浸提時(shí)間（D）＞料液比（B）。其中一次項(xiàng)A、C對(duì)黃酮得率的影響極顯著；一次項(xiàng)D和交互項(xiàng)AB、AC對(duì)黃酮得率的影響顯著，其余項(xiàng)對(duì)指標(biāo)影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 由圖5 可知，乙醇濃度與提取功率對(duì)黃酮的得率影響較大，提取時(shí)間、料液比次之，表3 的分析結(jié)果也與之吻合；乙醇濃度和料液比、乙醇濃度和提取功率兩者交互作用顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面走勢(shì)陡峭。

圖5 各因素交互作用對(duì)靈芝黃酮得率的影響

表3 回歸模型的方差分析

2.2.4 最佳提取工藝條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件求解二次回歸方程可得靈芝黃酮提取最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度86.68%、料液比1∶19.56（g/mL）、提取功率186.82 W、提取時(shí)間30.35 min，預(yù)測(cè)靈芝黃酮的提取得率為7.62%?？紤]到黃酮實(shí)際提取工作中操作的可行性將工藝參數(shù)修正為乙醇濃度86%、料液比1∶20（g/mL）、提取功率185 W、提取時(shí)間30 min。在此條件下對(duì)所建方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，靈芝黃酮的實(shí)際提取得率為7.55%，其與預(yù)測(cè)值7.62%誤差小于3%，因此證實(shí)了應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件得到的黃酮提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 小結(jié)與討論

靈芝作為一味珍貴的中藥材，具有廣泛的藥理作用。靈芝中富含氨基酸、真菌溶菌酶、麥角甾醇、三萜類化合物、黃酮等功能活性成分。氨基酸是含有堿性氨基和酸性羧基的有機(jī)化合物，陳體強(qiáng)等［26］曾研究報(bào)道野生靈芝與栽培靈芝中人體必需氨基酸組分與其含量，研究表明野生靈芝的必需氨基酸組成比例相對(duì)栽培靈芝更接近人體的必需氨基酸組成比例，又進(jìn)一步從紫芝子實(shí)體中檢出18 種氨基酸，總量為6.07%～6.38%。靈芝多糖的潛在價(jià)值巨大，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用核磁共振成像技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、高效陰離子交換色譜與脈沖安培檢測(cè)器聯(lián)用等新型現(xiàn)代技術(shù)對(duì)靈芝多糖進(jìn)行研究，分析發(fā)現(xiàn)靈芝多糖具有抗氧化性、消炎、抑制腫瘤細(xì)胞活性和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［27，28］。靈芝三萜化合物種類多、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要是由異戊二烯單位構(gòu)成的羊毛甾烷型，從靈芝中分離三萜類化合物目前有300 多種，按照碳原子數(shù)目可分為C24、C27和C30三大類；按照官能團(tuán)與側(cè)鏈的不同，可分為靈芝醛類、靈芝醇類、靈芝酸類和靈芝內(nèi)酯類等；靈芝三萜化合物在臨床上具有抗病毒、降血脂、保肝護(hù)肝和抗腫瘤等多種藥理功效［29，30］。黃酮化合物是指以 2-苯基苯并吡喃酮為母核的一大類天然化合物及其衍生物。研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、防止人體動(dòng)脈硬化、延緩衰老等功效［31，32］。靈芝各種功能活性成分已被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域，對(duì)靈芝中各種功能活性成分進(jìn)行提取可開(kāi)發(fā)成多種類型的功能食品及其他高附加值產(chǎn)品，有助于實(shí)現(xiàn)靈芝資源的高值化利用。

本試驗(yàn)采用靈芝為原料，用超聲輔助法提取其黃酮，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)提取溶劑乙醇濃度、料液比、提取功率、提取時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度86%、料液比1∶20（g/mL）、提取功率185 W、提取時(shí)間30 min。在此條件下對(duì)所建方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，靈芝黃酮的實(shí)際提取得率為7.55%，其與預(yù)測(cè)值7.62%誤差小于3%，因此證實(shí)了應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件得到的黃酮提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。