馬宇毅，李鵬舉，潘 艷

（1.廣西獸醫(yī)研究所，南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007）

隨著鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的大力推進(jìn)，廣西壯族自治區(qū)利用得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢(shì)大力發(fā)展山羊產(chǎn)業(yè)，同時(shí)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，山羊疫病日益復(fù)雜，尤其以呼吸道疾病最為顯著，病原以綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、肺炎克雷伯氏菌、隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌、巴氏桿菌、肺炎球菌、葡萄球菌等為主。傳染性胸膜肺炎傳播速度快、難以?xún)艋?，容易與其他疾病發(fā)生混合感染，增加了治療的難度，而不合理的用藥又容易造成病菌的耐藥性。因此，開(kāi)展病原的快速分離與鑒定，同時(shí)通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，可以有效地減少病菌耐藥性的產(chǎn)生，降低發(fā)病率，減少用藥成本，并達(dá)到有效控制疫病的目的。

2021 年3 月，廣西壯族自治區(qū)崇左市某山羊規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)大量羊只存在氣喘、咳嗽、打噴嚏、流鼻涕等癥狀，部分山羊還伴有腹瀉、拉稀，發(fā)病率達(dá)75%、死亡率為2%。剖檢發(fā)現(xiàn)病變以漿液性和纖維蛋白性肺炎以及胸膜炎為主，對(duì)內(nèi)臟進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)及PCR 鑒定，結(jié)果顯示主要病原為綿羊肺炎支原體和大腸桿菌，隨即選擇敏感藥物進(jìn)行針對(duì)性治療，同時(shí)加強(qiáng)生產(chǎn)管理與生物安全防控，有效地降低了養(yǎng)殖場(chǎng)山羊發(fā)病率，提高養(yǎng)殖效益?，F(xiàn)將該病例的診治情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2021 年3 月，廣西壯族自治區(qū)崇左市某種羊養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大量羊群伴有長(zhǎng)時(shí)間的氣喘、咳嗽、打噴嚏、流鼻涕、拉稀等癥狀，取癥狀明顯的山羊解剖，將內(nèi)臟裝于干凈的塑料袋內(nèi)，置于放有冰塊泡沫箱中送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.1.2 試劑 病毒DNA/RNA 提取試劑盒、100 bp Ladder、2×EsTaqMasterMix（Dye）、ddH2O 均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒、伊紅美藍(lán)平板購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；用于綿羊肺炎支原體（MO2）、絲狀支原體山羊亞種（MMMLC2）、多殺性巴氏桿菌A 型（PMA）與多殺巴氏桿菌D 型（PMD）PCR 擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 PCR 擴(kuò)增引物

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用酒精棉球?qū)Σ杉母鲀?nèi)臟取樣表層進(jìn)行消毒滅菌，選取病變較為明顯的部位剪開(kāi)，用無(wú)菌接種環(huán)蘸取病變組織部位劃線(xiàn)于伊紅美藍(lán)平板上，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)菌的革蘭氏染色鏡檢 用無(wú)菌接種環(huán)刮取單個(gè)菌落，涂布于滴加去離子水的載玻片上，采用革蘭氏染色法處理后進(jìn)行觀察。

1.2.3 病料DNA/RNA 的提取 將肺臟的病變部位剪取小部分，置于無(wú)菌研缽中，加入1 mL 的生理鹽水進(jìn)行研磨，直至組織樣品破碎，然后將研磨好的組織樣品裝入2 mL EP 管中，將裝有樣品的EP 管反復(fù)凍融3 次，使病菌細(xì)胞破裂，便于細(xì)菌DNA/RNA的提取。參考GB/T19915.4—2000 標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)樣品進(jìn)行PCR 鑒定。將EP 管中反復(fù)凍融的樣品在12 000 r/min 離心5 min，用移液槍吸取上層液體置于1.5 mL EP 管，加入蛋白酶K 后提取病料樣品的DNA/RNA，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR 鑒定 參考GB/T19915.4—2000 標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行 PCR 鑒定［2］。PCR 反應(yīng)體系為：2×EsTaqMaster Mix（Dye）13 μL；上、下游引物各 1 μL；樣品3 μL；補(bǔ)充 ddH2O 至 25 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度參考各引物的退火溫度見(jiàn)表1），72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 min 延伸4 min；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 用無(wú)菌接種環(huán)刮取單個(gè)菌落溶解于滅菌生理鹽水中，制備成0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，然后用無(wú)菌棉拭子蘸取菌懸液均勻涂布于MH 瓊脂平板上，將藥敏紙片貼在平板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，測(cè)量抑菌環(huán)的直徑并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離結(jié)果

在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上觀察到深紫黑色、光滑，帶有金屬光澤的圓形菌落［3］。同時(shí)，革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)呈兩端頓圓、粉紅色桿狀的形態(tài)，結(jié)合臨床癥狀綜合認(rèn)為是致病性大腸桿菌。

2.2 PCR 鑒定結(jié)果

對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，被檢測(cè)樣品中只有綿羊肺炎支原體在250～500 bp 之間出現(xiàn)目的條帶，其他樣品均無(wú)條帶，該羊只感染的病原菌是綿羊肺炎支原體［4］。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選擇24 種藥敏試紙片進(jìn)行致病性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。分離的致病性大腸桿菌對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、羅紅霉素、林可霉素、克拉霉素、克林霉素、鏈霉素、利福平、阿齊霉素、萬(wàn)古霉素不敏感；對(duì)頭孢他唑、阿米卡星、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素中度敏感；而對(duì)頭孢氨芐、頭孢西丁、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星、復(fù)方新諾明高度敏感。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 治療

隔離患病羊群是關(guān)鍵，以降低疾病的蔓延，從而便于精準(zhǔn)化用藥治療。治療措施如下：①酒石酸泰樂(lè)菌素注射液2～10 mg/kg 體重，皮下或肌肉注射，每天2 次，連用3 d；②氧氟沙星注射液2.5 mg/kg，肌肉注射，每天 2 次，連用 3 d［5］。

2.5 預(yù)防

制定科學(xué)免疫程序，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。日常飼養(yǎng)中杜絕羊群采食、飲用混有糞便的飼料與水，在飼料與飲水中加入麻杏石甘散、白頭翁、益生菌等中草藥及生物制劑，既可以抑制有害菌的生長(zhǎng)，又可以預(yù)防慢性的呼吸道疾病與消化道疾病。每個(gè)季度都要用阿苯達(dá)唑、伊維菌素、擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)羊群容易感染的線(xiàn)蟲(chóng)、球蟲(chóng)、羊螨蟲(chóng)等進(jìn)行消殺，保證羊群的健康。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)臨床初步診斷及實(shí)驗(yàn)室診斷，該山羊規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)疫病主要由山羊傳染性胸膜肺炎混合感染大腸桿菌病引起的，因此對(duì)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行疾病快速檢測(cè)與診斷，可以有效地減少發(fā)病率和傳染率，提高治療效果，降低養(yǎng)殖成本及養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)性。而使用高敏性抗菌藥物，既可以降低病菌的耐藥性又可以達(dá)到減少抗生素的濫用。規(guī)模化養(yǎng)殖還是主要以預(yù)防為主，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

通過(guò)對(duì)廣西某山羊規(guī)?；B(yǎng)殖基地進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)圈舍多以高1.2 m 全木式高架床為主，不銹鋼自動(dòng)飲水碗為主。但廣西常年高溫高濕，山羊又生性好斗，木條作為圈舍的基床底架很容易腐朽、歪斜、脫落、斷裂，容易造成山羊的卡腳，羊群的踩傷、甚至踩死。而不銹鋼飲水碗又容易被羊群撞壞甚至將糞便拉入飲水碗內(nèi)，進(jìn)而造成羊群因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間飲用不干凈的水源而產(chǎn)生疾病。在哺乳期圈舍中由于成年母羊與未斷奶小羊在共同的圈舍中，小羊穿梭于食草與圈舍之間，食草中常常混有小羊的糞便，也會(huì)影響羊群的健康。因此，應(yīng)該把圈舍合理規(guī)劃布局作為重點(diǎn)，才能更好地進(jìn)行養(yǎng)殖。而2 cm×2 cm 的鋼絲網(wǎng)床成為首選的目標(biāo)，結(jié)合鋼筋混凝土加固圈舍的建設(shè)，在混凝土墻體上設(shè)置凹槽，將不銹鋼飲水碗放置凹槽內(nèi)，防止羊群撞壞、拉入糞便進(jìn)去，對(duì)哺乳圈舍中的食槽做特殊處理，將食槽抬高至60 cm 的位置，防止小羊進(jìn)入食槽。在哺乳圈舍內(nèi)設(shè)置補(bǔ)飼欄，在哺乳期后1 個(gè)月內(nèi)進(jìn)行母乳+補(bǔ)飼的模式，提前使小羊適應(yīng)飼養(yǎng)情況，更有利于母羊恢復(fù)體況，進(jìn)行下批次的繁殖。