肖洋洋，馬忠臣，李芮芮，陳創(chuàng)夫，鄭 煒，王 勇，王鵬雁

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.綿羊健康養(yǎng)殖與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，石河子 832003；3.動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003)

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的人畜共患傳染性疾病[1]。感染該病后，母畜主要表現(xiàn)為妊娠期流產(chǎn)，早中期最為多見(jiàn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎，還伴有母畜的壞死性胎盤炎、子宮內(nèi)膜炎等；公畜主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，睪丸炎，不育；人則主要發(fā)生周期性發(fā)熱、乏力、多汗、關(guān)節(jié)炎，孕婦則可發(fā)生流產(chǎn)[2]。據(jù)調(diào)查，近年來(lái)該病在中國(guó)的發(fā)病率逐年上升[3-4]。由于還沒(méi)有研制出防治布魯氏菌病的理想疫苗，該病仍對(duì)全球的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展帶來(lái)挑戰(zhàn)[5]。

布魯氏菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，感染宿主之后，被吞噬細(xì)胞吞噬或侵入非吞噬細(xì)胞，會(huì)隱藏在膜結(jié)合室(該膜結(jié)合室被稱為布氏小體，BCV)中[6-7]。在初期，BCV利用胞吞途徑及分泌途徑來(lái)維持布魯氏菌的胞內(nèi)存活；在中期的成熟階段，BCV將抑制布魯氏菌與溶酶體的結(jié)合，逃避宿主的免疫殺傷作用；在后期，BCV與分泌途徑相互作用從而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合，其還會(huì)與內(nèi)吞途徑相互作用觸發(fā)自噬，滿足布魯氏菌長(zhǎng)期在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)與增殖的條件[8-9]。研究證實(shí)，布魯氏菌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的增殖過(guò)程中可以使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)重組，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)，從而促進(jìn)布魯氏菌的胞內(nèi)寄生[10-11]。免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin-binding protein，Bip/GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志分子，ERS發(fā)生時(shí)，Bip的表達(dá)量增加，可以激活UPR[12]。

BspI是一個(gè)新的效應(yīng)蛋白，由布魯氏菌1號(hào)染色體BAB1-1865基因編碼，有GTPase活化域(98-220位氨基酸)、信號(hào)肽域(1-17位氨基酸)和轉(zhuǎn)膜域(17-33位氨基酸)3個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域[13]。GTPase活化域理論上能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小G蛋白的活性，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的組裝[14]。研究表明，BspI蛋白可以上調(diào)小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)Bip的表達(dá)，并可以誘導(dǎo)白介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌增多，剪切型X盒結(jié)合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP-1S)表達(dá)量增加，表明BspI蛋白可以作用于RAW264.7細(xì)胞，誘導(dǎo)RAW264.7中的ERS，并激活ERS中的UPR[15],在布魯氏菌的胞內(nèi)寄生中發(fā)揮了重要的作用。BspI作為分泌蛋白，其分泌途徑尚不清楚，因此，本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出布魯氏菌分泌蛋白BspI，免疫試驗(yàn)兔后制備兔抗BspI多克隆抗體，以期為后續(xù)進(jìn)行該蛋白的亞細(xì)胞定位及潛在功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和試驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，滅活羊種16M布魯氏菌菌株均由新疆疾病預(yù)防控制中心提供；pMD19-T克隆載體、pET-28a表達(dá)載體均購(gòu)自TaKaRa公司；2只2月齡雄性新西蘭大白兔(約1.5 kg)購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌質(zhì)粒小提中量試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、DAB顯色液均自天根生化科技(北京)有限公司；誘導(dǎo)劑IPTG購(gòu)自Merck公司；T4 DNA連接酶、2×EsTaqMasterMix、DNA快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ均購(gòu)自TaKaRa公司；綿羊抗兔IgG、脫脂奶粉、PVDF膜均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 BspI蛋白的生物信息學(xué)分析 利用TMHMM Server v.2.0在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)BspI蛋白的跨膜區(qū)；利用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)BspI蛋白的親/疏水性；利用件SignalP 5.0 Server在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)BspI蛋白的信號(hào)肽；利用NetPhos 3.1 Server在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)BspI蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用Predicting Anti-genic Peptides在線軟件(http:∥imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預(yù)測(cè)BspI蛋白的抗原決定簇；利用SOPMA在線軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html)預(yù)測(cè)BspI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL在線軟件(http:∥swiss-model.expasy.org/)對(duì)BspI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)自動(dòng)建立空間模型。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)布魯氏菌菌株16MBspI基因序列(GenBank登錄號(hào)：DK63_1233，675 bp)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物BspI-F/R，BspI-F：5′-GGATCCATGCTTGGCG-

TTCTCGTGGC-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))；BspI-R：5′-CTCGAGCTATTGCATGTCGCGG-

ATGC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以滅活羊種布魯氏菌菌株16M菌液為模板，進(jìn)行目的基因BspI的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 9.7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并對(duì)鑒定正確的產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。

1.2.3 pMD19-T-BspI克隆載體的構(gòu)建與鑒定 回收純化的BspI基因與pMDl9-T克隆載體連接，16 ℃水浴過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂含氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑菌活化進(jìn)行菌液PCR鑒定并送昆泰銳生物技術(shù)有限公司(武漢)測(cè)序，連接成功后的產(chǎn)物命名為pMD19-T-BspI。

1.2.4 pET-28a-BspI重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將pMD19-T-BspI和pET-28a載體搖菌提取質(zhì)粒，同時(shí)用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，回收pET-28a載體及目的片段。pET-28a載體與目的片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂含卡那抗性的固體LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑菌活化進(jìn)行菌液PCR并送昆泰銳生物技術(shù)有限公司(武漢)測(cè)序，連接成功后的產(chǎn)物命名為pET-28a-BspI。

1.2.5 BspI的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，活化后接種于含卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌至D600 nm值為0.7。加入誘導(dǎo)劑1 mmol/L IPTG，分別于0、2、4、6及8 h取出對(duì)應(yīng)的菌液，12 000 r/min離心1 min，加入80 μL蒸餾水和20 μL蛋白上樣液混勻，100 ℃沸水浴10 min，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)600～800 mL，搖菌至D600 nm值為0.7，加入誘導(dǎo)劑1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)至最佳時(shí)間收菌，置于液氮中反復(fù)凍融3次，超聲破碎離心，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。利用His標(biāo)簽蛋白純化柱進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化，純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，并使用BCA試劑盒測(cè)定濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 BspI多克隆抗體的制備 將純化后的蛋白混合弗氏佐劑免疫試驗(yàn)兔，免疫前耳動(dòng)脈采血1～2 mL做陰性對(duì)照，首免按每800 μg/只混合等體積弗氏完全佐劑，乳化后皮下5點(diǎn)注射；間隔3周，耳動(dòng)脈采血1～2 mL后進(jìn)行二免，800 μg蛋白混合等體積弗氏不完全佐劑，乳化后皮下5點(diǎn)注射；間隔3周，耳動(dòng)脈采血1～2 mL用作Western blotting及ELISA檢測(cè)，同時(shí)三免，500 μg蛋白混合等體積弗氏不完全佐劑，乳化后皮下5點(diǎn)注射；間隔2周四免，500 μg蛋白混合弗氏不完全佐劑，乳化后皮下5點(diǎn)注射；間隔1周，耳中動(dòng)脈采血1～2 mL用于Western blotting及ELISA檢測(cè)，3 d后頸動(dòng)脈采血50 mL。

1.2.7 多克隆抗體的鑒定 取純化后的BspI蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，切下目的膠塊將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，以制備的兔抗BspI蛋白多克隆抗體(稀釋比1∶100)為一抗，37 ℃孵育2 h；山羊抗兔IgG-HRP(稀釋比1∶3 500)為二抗，37 ℃孵育2 h，用DAB顯色液顯色，拍照留存。

1.2.8 多克隆抗體效價(jià)的間接ELISA檢測(cè) 取純化后的BspI蛋白稀釋為1.5、2、2.5 μg/mL包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；以制備的多克隆抗體為一抗，稀釋為1∶200、1∶250、1∶300和1∶350，37 ℃避光孵育1 h；以山羊抗兔IgG-HRP為二抗，稀釋度為1∶10 000、1∶20 000、1∶30 000和1∶40 000，37 ℃避光孵育30 min，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，TMB顯色15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值。

2 結(jié) 果

2.1 BspI蛋白的生物信息學(xué)分析

2.1.1 跨膜區(qū)、親/疏水性和信號(hào)肽預(yù)測(cè) BspI蛋白分子式為C1151H1835N339O292S6，編碼220個(gè)氨基酸，根據(jù)TMHMM Server v.2.0在線軟件分析，BspI蛋白有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(圖1)。利用ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，BspI蛋白親水性平均系數(shù)為0.789，為親水性蛋白(圖2)。利用SignalP 5.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)顯示，BspI蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖3)。

圖1 BspI蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Transmembrane structure prediction of BspI protein

圖2 BspI蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of BspI protein

圖3 BspI蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3 Signal peptide prediction of BspI protein

2.1.2 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用NetPhos 3.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)BspI蛋白的磷酸化位點(diǎn)，高于閾值0.5的為潛在磷酸化位點(diǎn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白在第1、42、49、76、111、127、208位絲氨酸處，第52、78、91、112、206位蘇氨酸處，以及第68位酪氨酸處發(fā)生了磷酸化(圖4)。

圖4 BspI蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 Phosphorylation site prediction of BspI protein

2.1.3 抗原決定簇預(yù)測(cè) 通過(guò)在線軟件Predicting Anti-genic Peptides進(jìn)行預(yù)測(cè)，該蛋白有7個(gè)抗原決定簇，分別在7-49、79-89、98-111、113-142、165-171、175-183、205-216位氨基酸處(表1)。

表1 BspI蛋白抗原決定簇預(yù)測(cè)

2.1.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 根據(jù)SOPMA在線軟件分析，BspI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲占比分別為30.45%、29.55%、10.45%和29.55%(圖5)。根據(jù)SWISS-MODEL在線軟件對(duì)BspI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)自動(dòng)建立空間模型，顯示以α-螺旋為主(圖6)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

線條從長(zhǎng)到短依次為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲The order of lines from long to short are alpha helix,extended chain,beta turn and random coil圖5 BspI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of BspI protein

圖6 BspI蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Tertiary structure prediction of BspI protein

2.2 BspI蛋白多克隆抗體制備

2.2.1BspI基因PCR擴(kuò)增 以布魯氏桿菌菌株16M為模板，以特異性引物BspI-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示BspI基因片段大小為675 bp(圖7)，與預(yù)期相符。

M,DL2000 DNA Marker；1，陰性對(duì)照；2～4，BspI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M,DL2000 DNA Marker;1，Negative control；2-4，PCR amplification products of BspI gene圖7 BspI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of BspI gene

2.2.2 重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-BspI的菌液PCR鑒定 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，將其連接到pMD19-T克隆載體上，經(jīng)菌液PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，條帶大小為675 bp(圖8)，與預(yù)期相符。測(cè)序比對(duì)表明重組質(zhì)粒pMD19-T-BspI構(gòu)建成功。

M,DL2000 DNA Marker;1,陰性對(duì)照;2～6,pMD19-T-BspI的菌液PCR產(chǎn)物M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2-6,PCR products of bacterial solution of pMD19-T-BspI圖8 pMD19-T-BspI菌液PCR驗(yàn)證Fig.8 PCR results of pMD19-T-BspI bacterial solution

2.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BspI的菌液PCR鑒定 重組質(zhì)粒pMD19-T-BspI和載體pET-28a分別被BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，條帶大小為675 bp(圖9)，與預(yù)期相符。表明BspI基因已成功插入pET-28a表達(dá)載體中。

M,DL2000 DNA Marker;1,陰性對(duì)照;2、3,pET-28a-BspI的PCR產(chǎn)物M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2 and 3,PCR products of pET-28a-BspI圖9 pET-28a-BspI菌液PCR驗(yàn)證Fig.9 PCR results of pET-28a-BspI bacterial solution

2.2.4 BspI蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 分別取未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)2、4、6、8 h的菌液及菌液超聲后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，BspI蛋白(25.3 ku)會(huì)形成包涵體，在上清中不表達(dá)，37 ℃誘導(dǎo)8 h左右蛋白的表達(dá)量最高(圖10)；經(jīng)His標(biāo)簽鎳柱純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在約25.3 ku處出現(xiàn)單一的條帶(圖11)，表明BspI蛋白純化成功，且濃度為1.5 mg/mL。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1，空菌對(duì)照；2～5，表達(dá)菌誘導(dǎo)2、4、6、8 h；6，超聲后的上清液；7，超聲后的沉淀M，Protein Marker;1,Control of empty bacteria;2-5,The expression bacteria were induced for 2,4,6 and 8 h，respectively;6,Supernatant after ultrasound;7,Precipitate after ultrasound圖10 BspI蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of induced expression of BspI protein

2.2.5 BspI多克隆抗體的Western blotting鑒定 將純化后的BspI蛋白轉(zhuǎn)到0.45 μm的PVDF膜，以免疫后的兔血清為一抗、山羊抗兔IgG-HRP為二抗孵育，用DAB顯色液顯色，在25.3 ku左右出現(xiàn)了一條特異性、較粗的條帶(圖12)，表明兔血清里面含有抗BspI蛋白的抗體，可以與純化后的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，因蛋白濃度較高，所以條帶較粗。Western blotting結(jié)果表明，BspI免疫兔后，兔體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)BspI蛋白的抗體，因此利用采集的血清作為一抗時(shí)，血清內(nèi)抗體可以與BspI蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，表明多克隆抗體制備成功。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1、2,經(jīng)His標(biāo)簽鎳柱純化、濃縮后的蛋白M，Protein Marker;1 and 2,The protein was purified and concentrated over the His tagged nickel column圖11 BspI蛋白純化結(jié)果Fig.11 Purification results of BspI protein

1、2,BspI蛋白的DAB顯色；M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1 and 2,DAB color rendering of BspI protein；M，Protein Marker圖12 BspI多克隆抗體的Western blotting鑒定Fig.12 Western blotting identification of BspI polyclonal antibody

2.2.6 BspI多克隆抗體的間接ELISA抗體效價(jià)分析 首先通過(guò)方陣滴定法確定蛋白的最佳包被濃度，三免后收集血清，以免疫前的兔血清作陰性對(duì)照，得到蛋白的最佳包被濃度為1.5 μg/mL，在BspI蛋白的最佳包被濃度為1.5 μg/mL、一抗稀釋度為1∶350、二抗稀釋度為1∶40 000時(shí)，P/N值最大為8.696(表2)。通過(guò)倍比稀釋對(duì)BspI蛋白的抗體效價(jià)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在一抗稀釋度為1∶12 800時(shí)，血清中的抗體與BspI蛋白的結(jié)合度達(dá)到最高；在一抗稀釋度為1∶409 600時(shí)，P/N值開(kāi)始<2，表明制備的抗體可以很好地與BspI蛋白結(jié)合，抗體效價(jià)為1∶409 600(圖13)。

表2 方陣滴定結(jié)果(P/N)

圖13 兔抗BspI蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定Fig.13 Titer determination of rabbit polyclonal antibody against BspI protein

3 討 論

布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌，侵入機(jī)體后分布于各個(gè)組織器官，胎衣、胎兒、胎盤以及乳腺、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、淋巴結(jié)最有利于其增殖[16]。研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的胞內(nèi)寄生機(jī)制與Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)有密切的聯(lián)系[17]。T4SS的表達(dá)是布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒力的一個(gè)重要標(biāo)志[18-19]。布魯氏菌的效應(yīng)蛋白分泌有兩種：依賴T4SS和非依賴T4SS[20]。目前，對(duì)依賴T4SS的蛋白研究已經(jīng)很成熟，依賴型效應(yīng)蛋白在布魯氏菌感染宿主及誘發(fā)ERS反應(yīng)中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，而非依賴型效應(yīng)蛋白的研究較少[21]。BspI蛋白是非依賴T4SS的分泌蛋白，能參與布魯氏菌胞內(nèi)感染引起宿主細(xì)胞的ERS[22]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)布魯氏菌分泌蛋白BspG和BspJ的研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)蛋白都可以進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核，能夠在細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)間穿梭，而B(niǎo)spI具有和這2個(gè)蛋白相似的分泌方式，因此推測(cè)BspI也可能會(huì)進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核，影響宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和基因的表達(dá)，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的生存與繁殖，使布魯氏菌能在胞內(nèi)長(zhǎng)期生存。然而該推測(cè)還需要對(duì)BspI進(jìn)行更進(jìn)一步的分析及驗(yàn)證。

本研究利用在線軟件分別對(duì)BspI蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、親/疏水性、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、抗原決定簇進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，BspI蛋白編碼220個(gè)氨基酸，有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，不含信號(hào)肽，有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)抗原決定簇，是一個(gè)不穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白被預(yù)測(cè)為跨膜的親水蛋白，但不含信號(hào)肽，表明該蛋白可能定位于細(xì)胞膜上，而Myeni等[23]通過(guò)CyaA報(bào)告子融合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在C-端融合報(bào)告子時(shí)，BspI的分泌是依賴VirB T4SS的；當(dāng)標(biāo)記在N-端時(shí)，BspI的分泌不依賴于VirB T4SS。在布魯氏菌的效應(yīng)蛋白中，BspD、BspH、BspJ都與BspI分泌方式相似[24]。表明布魯氏菌中可能存在另一種未發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng)，而B(niǎo)spI蛋白可能是通過(guò)T4SS和這種分泌系統(tǒng)混合分泌到宿主細(xì)胞。同時(shí)，有研究顯示，費(fèi)氏弧菌可以通過(guò)鞭毛調(diào)控外膜蛋白的分泌來(lái)影響細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的毒力[25]，而布魯氏菌和費(fèi)氏弧菌都是單極鞘鞭毛[26]，推測(cè)布魯氏菌的鞭毛能夠和T4SS共同調(diào)控一些效應(yīng)蛋白的分泌，但仍有待進(jìn)一步研究。對(duì)BspI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲組成，α-螺旋占比最大(30.45%)。生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，BspI蛋白具有7個(gè)抗原決定簇，表明該蛋白作為抗原可以引起宿主良好的免疫反應(yīng)。

本研究還通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BspI蛋白進(jìn)行表達(dá)，免疫試驗(yàn)兔制備了多克隆抗體。在表達(dá)及純化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BspI蛋白在上清中基本沒(méi)有表達(dá)，在沉淀中形成包涵體，包涵體蛋白的純化過(guò)程非常繁瑣，且在復(fù)性過(guò)程中BspI蛋白極易變性析出，這與生物信息學(xué)分析時(shí)得出的該蛋白不穩(wěn)定性較高的結(jié)果一致。因此在試驗(yàn)過(guò)程中嘗試在蛋白中加入10%甘油，增加溶液的黏性，減少蛋白質(zhì)之間的相互碰撞而沉淀，發(fā)現(xiàn)可以明顯減少蛋白的析出變性。使用純化后的蛋白免疫兔后，在2周左右即可通過(guò)Western blotting檢測(cè)到抗體；三免后用間接ELISA法測(cè)定制備的多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示抗體效價(jià)在1∶409 600左右，表明該蛋白具有較好的免疫原性及反應(yīng)原性，為今后亞單位疫苗的研發(fā)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。通過(guò)BspI蛋白的生物信息學(xué)和多克隆抗體的效價(jià)分析表明，BspI蛋白可能對(duì)布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存與繁殖有一定的影響，從而有利于布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期生存，也可為進(jìn)一步研究BspI蛋白的亞細(xì)胞定位和布魯氏菌鞭毛對(duì)分泌蛋白的調(diào)控提供材料，為研究BspI蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。

4 結(jié) 論

BspI蛋白為親水性蛋白，有跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)抗原決定簇，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲為主要組成部分；成功構(gòu)建了布魯氏菌分泌蛋白BspI的原核表達(dá)載體，表達(dá)純化出25.3 ku的蛋白，并免疫試驗(yàn)兔獲得了多克隆抗體，抗體效價(jià)為1∶409 600，具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性。