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        基于生物信息學鑒定膝關節(jié)骨性關節(jié)炎滑膜炎性反應的關鍵基因和通路

        2022-08-22 06:05:02陳繼明
        吉林醫(yī)學 2022年8期
        關鍵詞:信號分析

        陳 鵬,趙 超,胡 珍,陳繼明

        (1.江西省都昌縣中醫(yī)院,江西 九江 332600;2.江西省都昌縣人民醫(yī)院,江西 九江 332600)

        膝骨關節(jié)炎(KOA)是最常見的骨關節(jié)退行性病變,主要病理表現(xiàn)為軟骨退變、滑膜炎性反應及軟骨下硬化和骨贅形成[1-3]。據(jù)報道全球約有2.4億人患有KOA[4]。軟骨損傷被認為是導致KOA進展的關鍵病理因素[5]。但是,隨著醫(yī)學的飛速發(fā)展,人們越來越認識到滑膜炎性反應在KOA發(fā)病中的關鍵作用[6-8]。 Mancarella等[7]提出滑膜炎性反應驅動了KOA病理過程中的軟骨損傷。同時,許多臨床研究表明,滑膜炎性反應與KOA癥狀如關節(jié)疼痛、僵硬和軟骨損傷顯著相關[9-10]。因此,了解滑膜炎性反應的病理過程在KOA的治療中有重要作用。

        隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學的發(fā)展,越來越多的證據(jù)表明KOA的發(fā)生和發(fā)展是由多種基因和信號通路介導的。在過去的十年中,高通量技術已經(jīng)報道了有關KOA基因表達譜研究的大量數(shù)據(jù),并揭示了許多差異表達基因(DEG)涉及不同的途徑,生物過程(BP)或分子功能(MF)[11]。生物信息學方法可以整合多個基因表達譜的數(shù)據(jù),使人們能夠研究KOA中mRNA表達的變化以及DEG之間的相互作用,從而為進一步的KOA研究提供了新的見識。因此,本研究旨在通過生物信息學分析法鑒定KOA滑膜組織中涉及的生物標志物和通路,在分子水平上為KOA進展提供新的見解。

        1 資料與方法

        1.1數(shù)據(jù)集下載:在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中以'knee osteoarthritis'為檢索詞檢索KOA滑膜組織的測序數(shù)據(jù)集,得到GSE55235和GSE55457兩個基因表達數(shù)據(jù)集,兩個數(shù)據(jù)集均使用GPL96平臺處理。GSE55235和GSE55457共含有40個滑膜組織,包括健康關節(jié)的20個滑膜組織和KOA關節(jié)的20個滑膜組織。兩個數(shù)據(jù)集的詳細信息可見表1。

        1.2DEG的篩選和鑒定:使用R軟件中的RPA[12]和sva軟件包[13]避免批次效應,通過ggpolt2軟件包[14]進行箱形圖驗證了兩個數(shù)據(jù)集的規(guī)范化。使用limma軟件包[15]分析確定DEG,以| log2(倍數(shù)變化)|>1和P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義的DEG。使用火山圖和熱圖顯示具有統(tǒng)計學意義的DEG。 使用R軟件中的ggplot2和pheatmap軟件包[16]生成火山圖和熱圖,顯示具有統(tǒng)計學意義的DEG。

        1.3功能和途徑富集分析:GO富集分析[17]從三個方面來描述基因功能和關系的概念,即BP,細胞組分(CC)和MF。使用DAVID數(shù)據(jù)庫[18]對DEG進行GO和KEGG通路富集分析,然后使用R軟件進行可視化。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

        1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建和模塊分析:使用STRING數(shù)據(jù)庫[19]構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡。選擇相互作用評分>0.4的DEG在Cytoscape軟件中進行可視化。使用MCODE插件進行子模塊分析,以鑒定更多連接的基因組[20]。標準設置如下:MCODE分值>5,節(jié)點數(shù)>6。并同時對子模塊進行功能和通路富集分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

        2 結果

        2.1數(shù)據(jù)集的歸一化:GSE55235和GSE55457均從GEO數(shù)據(jù)庫下載的,并使用RPA和sva軟件包用于規(guī)范化數(shù)據(jù)并避免批處理效應。見圖1A所示,方框圖顯示的黑線基本處于同一水平;主成分分析(PCA)顯示,對照組和OA組存在明顯的聚類,各組之間存在顯著差異。見圖1B。

        注:A為對DEG進行歸一化后的箱線圖,黑線所示的箱線圖基本處于同一水平,這表明兩個數(shù)據(jù)集的患者是統(tǒng)一且可比的,兩者之間的偏差很??;B為所有納入樣本的主成分分析(PCA),在對照組和OA組中均顯示出明顯的簇,兩組之間存在顯著差異

        2.2鑒定具有統(tǒng)計意義的DEG:使用limma軟件包對比正常組與OA組滑膜組織中的DEG。見圖2所示,總共觀察到279個DEG,包括133個基因被上調和146個基因被下調。圖3顯示了所有上調和下調的DEG的熱圖。

        注:紅點表示上調的基因,藍點表示下調的基因,黑點表示無統(tǒng)計學差異的基因

        注:紅色表示較高的基因表達,藍色表示較低的基因表達

        2.3DEG的GO和KEGG通路富集分析:見圖4所示,GO富集分析結果顯示,在生物學過程(GO-BP)上,DEGs主要富集在“免疫反應”,“細胞黏附”和“炎性反應”等;在分子功能(GO-MF)上,DEG主要通過調節(jié)“肝素結合”,“絲氨酸型內肽酶活性”和“抗原結合”發(fā)揮分子功能;在細胞組分上,DEG主要在“細胞外囊泡”,“細胞外區(qū)域”和“細胞外空間”中顯著富集。

        圖4 DEG的前10個GO富集結果

        DEG的KEGG通路富集分析結果見圖5所示,提示DEGs主要通過“類風濕性關節(jié)炎”,“TNF信號傳導途徑”,“破骨細胞分化”和“ECM-受體相互作用”等途徑發(fā)揮重要作用。

        圖5 DEG的前20條KEGG通路富集分析結果

        2.4PPI網(wǎng)絡構建和hub基因篩選:使用STRING數(shù)據(jù)庫構PPI網(wǎng)絡,并選擇相互作用評分>0.4的具有統(tǒng)計學意義的DEG在Cytoscape軟件中進行可視化處理,見圖6。排名前20位的hub基因包括細胞白介素(IL)-6,原始原癌基因(JUN),CXC基序趨化因子配8(CXCL8),血管內皮生長因子A(VEGFA),核因子κB抑制劑α(NFKBIA),基質金屬蛋白酶(MMP)1,MMP9等。表1列出了前20個hub基因的詳細信息。在這些基因中,IL-6,JUN和VEGFA具有最高的節(jié)點度,表明其在滑膜炎性反應過程中起關鍵作用。

        表1 前20個hub基因的詳細信息

        紅色表示較高程度的基因,黃色表示較低程度的基因

        2.5子模塊分析:在PPI網(wǎng)絡中共鑒定出兩個MCODE分值>5且節(jié)點數(shù)>6的模塊。模塊1(MCODE分數(shù)=6.438)包括33個節(jié)點,模塊2(MCODE分數(shù)=5.111)包括10個節(jié)點。KEGG通路分析結果如圖7A和B所示,結果表明模塊中的DEG在“IL-17信號通路”,“ECM-受體相互作用”,“破骨細胞分化”,“NF-κB信號通路”中顯著富集。IL-17信號通路在兩個模塊中均顯著富集,提示其可能在OA發(fā)展過程中起關鍵作用。

        圖7 DEG的子模塊的通路富集分析。

        3 討論

        隨著醫(yī)療技術的飛速發(fā)展,已將許多方法用于治療KOA,包括物理療法、非甾體類抗炎藥、關節(jié)鏡和關節(jié)置換術等。不幸的是,目前沒有辦法有效地逆轉或阻止KOA的進展[21]。全膝關節(jié)置換術(TKA)被認為是治療終末期KOA的最后選擇,但TKA也存在諸如感染、翻修、功能不滿意等并發(fā)癥[22-23]。因此,研究骨關節(jié)炎的發(fā)病機理并尋找治療KOA的有效方法一直是研究的重點。過去一般認為滑膜炎性反應被認為是由軟骨磨損導致的碎片引起的[24]。但是,最近的研究[25]顯示,滑膜炎性反應可以被認為是骨關節(jié)炎的先兆,在放射學檢查發(fā)現(xiàn)軟骨損傷之前就已經(jīng)存在。此外,有學者認為滑膜和脂肪膜下墊可被視為解剖功能單元,在KOA發(fā)生過程中加速軟骨損傷并引起疼痛[26]。因此,探索滑膜炎性反應的發(fā)病機制可能為KOA的治療提供新的視角。

        本文納入了兩個GEO數(shù)據(jù)集,并使用生物信息學方法分析了279個DEG,包括133個上調基因和146個下調基因,并進行了GO和KEGG通路富集分析,以探索DEG在KOA進展過程中的生物學機制。KEGG通路富集分析結果顯示DEG主要在“類風濕關節(jié)炎”,“TNF信號途徑”,“PI3K-Akt信號途徑”和“破骨細胞分化”等通路富集,這與先前發(fā)表的文章相似[27-29]。GO富集結果顯示DEG主要富集在了“免疫反應”,“細胞黏附”和“炎性反應”等生物學過程。先前的研究表明,先天和后天免疫系統(tǒng)在OA過程中起關鍵作用[30],并表明骨關節(jié)炎是一種炎性反應性疾病[31]。有趣的是,GO-CC分析結果顯示DEG主要富集在“細胞外囊泡”,“細胞外區(qū)域”和“細胞外空間”。外泌體是30-150 nm大小的細胞外囊泡,帶有脂質雙層膜,其中包含許多生物活性物質,如非編碼RNA、蛋白質和mRNA,在細胞間通訊中起重要作用[32-34]。這些DEG可以通過滑膜分泌到外泌體中,并被關節(jié)周圍的組織(如軟骨和脂肪墊)吸收,然后放大炎性反應并加重軟骨損傷,這進一步解釋了滑膜炎性反應在OA中的關鍵作用。

        此外,本文構建了DEG的PPI網(wǎng)絡,并使用Cytoscape軟件進行可視化并根據(jù)自由度鑒定hub基因,結果顯示 IL-6,JUN和VEGFA具有最高的自由度。IL-6是一種炎性細胞因子,參與各種生物過程,包括炎性反應、免疫反應以及癌癥[35]。IL-6啟動子區(qū)的多態(tài)性引起歐洲人對類風濕性關節(jié)炎的易感性[36],并與老年人骨關節(jié)炎的嚴重程度和功能狀態(tài)有關[37]。托珠單抗是一種IL-6抑制劑,可減輕OA引起的中樞敏化和慢性疼痛,并保留關節(jié)軟骨并增加骨量[38-39]。JUN是另一個hub基因,AP-1是JUN的激活蛋白,可以通過多種刺激調節(jié),包括炎性細胞因子,氧化應激等[40]。許多MMPs啟動子包含潛在的AP-1結合位點,并且被細胞因子激活的AP-1也可以調節(jié)MMP表達。Tang等[41]提出c-JUN/AP-1信號通路調節(jié)人滑膜成纖維細胞中IL-6的表達。VEGFA是VEGF家族的創(chuàng)始成員,通常被稱為VEGF[42]。VEGF在骨骼發(fā)育和骨重構中起著調節(jié)血管生成的關鍵作用,并被懷疑在OA的發(fā)病機理中起著關鍵作用[43]。膝關節(jié)內注射VEGF可誘導OA樣變化,如關節(jié)軟骨降解、蛋白聚糖丟失、滑膜炎性反應以及軟骨下硬化[44]。臨床證據(jù)表明VEGF水平升高與OA進展有關[42,45]。最近的臨床前研究也顯示抑制VEGF可有效預防OA的關節(jié)破壞并減輕相關疼痛[42]。

        最后,PPI網(wǎng)絡的子模塊分析表明,OA的發(fā)展與“IL-17信號通路”,“ECM-受體相互作用”,“破骨細胞分化”,“NF-κB信號通路”等相關。IL-17信號通路在這兩個模塊中都顯著富集,提示其可能在OA過程中起關鍵作用。IL-17主要由Th17細胞產(chǎn)生,Th17細胞是CD4+T細胞的一個亞群,主要參與誘導自身免疫和炎性疾病[46]。Liu等[47]發(fā)現(xiàn)與對照組相比,IL-17在OA中的表達明顯更高患者,并阻斷IL-17信號通路可延遲與OA相關的疼痛。同時,IL-17信號通路可以激活NF-kB和MAPK通路,而這些通路與OA的發(fā)展密切相關[48]?;|金屬蛋白酶(MMPs)是一種促進軟骨分解,降解細胞外基質(ECM)成分并在OA中起重要病理作用的酶家族[49]。許多文章使用MMPs的表達水平來反映OA中軟骨損傷的程度,尤其是MMP-1、-3和-9[50-52]。PTGS2是與炎性反應相關的基因,在骨關節(jié)炎中高度相關[53]。NFKBIA、FOSB和JUND都與NF-kB和MAPK信號通路密切相關,它們在OA的病理過程中起著至關重要的作用[54-55]。

        綜上所述,本研究在OA滑膜炎性反應過程中鑒定出279個DEG,這些DEG顯著富集在“風濕性關節(jié)炎”,“TNF信號傳導途徑”,“PI3K-Akt信號傳導途徑”和“破骨細胞分化”等通路。GO-CC的結果提示滑膜將DEGs釋放至外泌體,在KOA的信號傳遞中起關鍵作用,并加劇KOA進展。IL-17信號通路可能是治療KOA的重要靶標。

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