陳 鵬，趙 超，胡 珍，陳繼明

(1.江西省都昌縣中醫(yī)院，江西 九江 332600；2.江西省都昌縣人民醫(yī)院，江西 九江 332600)

膝骨關節(jié)炎(KOA)是最常見的骨關節(jié)退行性病變，主要病理表現(xiàn)為軟骨退變、滑膜炎性反應及軟骨下硬化和骨贅形成[1-3]。據(jù)報道全球約有2.4億人患有KOA[4]。軟骨損傷被認為是導致KOA進展的關鍵病理因素[5]。但是，隨著醫(yī)學的飛速發(fā)展，人們越來越認識到滑膜炎性反應在KOA發(fā)病中的關鍵作用[6-8]。 Mancarella等[7]提出滑膜炎性反應驅動了KOA病理過程中的軟骨損傷。同時，許多臨床研究表明，滑膜炎性反應與KOA癥狀如關節(jié)疼痛、僵硬和軟骨損傷顯著相關[9-10]。因此，了解滑膜炎性反應的病理過程在KOA的治療中有重要作用。

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明KOA的發(fā)生和發(fā)展是由多種基因和信號通路介導的。在過去的十年中，高通量技術已經(jīng)報道了有關KOA基因表達譜研究的大量數(shù)據(jù)，并揭示了許多差異表達基因(DEG)涉及不同的途徑，生物過程(BP)或分子功能(MF)[11]。生物信息學方法可以整合多個基因表達譜的數(shù)據(jù)，使人們能夠研究KOA中mRNA表達的變化以及DEG之間的相互作用，從而為進一步的KOA研究提供了新的見識。因此，本研究旨在通過生物信息學分析法鑒定KOA滑膜組織中涉及的生物標志物和通路，在分子水平上為KOA進展提供新的見解。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)集下載：在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中以'knee osteoarthritis'為檢索詞檢索KOA滑膜組織的測序數(shù)據(jù)集，得到GSE55235和GSE55457兩個基因表達數(shù)據(jù)集，兩個數(shù)據(jù)集均使用GPL96平臺處理。GSE55235和GSE55457共含有40個滑膜組織，包括健康關節(jié)的20個滑膜組織和KOA關節(jié)的20個滑膜組織。兩個數(shù)據(jù)集的詳細信息可見表1。

1.2DEG的篩選和鑒定：使用R軟件中的RPA[12]和sva軟件包[13]避免批次效應，通過ggpolt2軟件包[14]進行箱形圖驗證了兩個數(shù)據(jù)集的規(guī)范化。使用limma軟件包[15]分析確定DEG，以| log2(倍數(shù)變化)|>1和P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義的DEG。使用火山圖和熱圖顯示具有統(tǒng)計學意義的DEG。 使用R軟件中的ggplot2和pheatmap軟件包[16]生成火山圖和熱圖，顯示具有統(tǒng)計學意義的DEG。

1.3功能和途徑富集分析：GO富集分析[17]從三個方面來描述基因功能和關系的概念，即BP，細胞組分(CC)和MF。使用DAVID數(shù)據(jù)庫[18]對DEG進行GO和KEGG通路富集分析，然后使用R軟件進行可視化。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建和模塊分析：使用STRING數(shù)據(jù)庫[19]構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡。選擇相互作用評分>0.4的DEG在Cytoscape軟件中進行可視化。使用MCODE插件進行子模塊分析，以鑒定更多連接的基因組[20]。標準設置如下：MCODE分值>5，節(jié)點數(shù)>6。并同時對子模塊進行功能和通路富集分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

2 結果

2.1數(shù)據(jù)集的歸一化：GSE55235和GSE55457均從GEO數(shù)據(jù)庫下載的，并使用RPA和sva軟件包用于規(guī)范化數(shù)據(jù)并避免批處理效應。見圖1A所示，方框圖顯示的黑線基本處于同一水平；主成分分析(PCA)顯示，對照組和OA組存在明顯的聚類，各組之間存在顯著差異。見圖1B。

注：A為對DEG進行歸一化后的箱線圖，黑線所示的箱線圖基本處于同一水平，這表明兩個數(shù)據(jù)集的患者是統(tǒng)一且可比的，兩者之間的偏差很??；B為所有納入樣本的主成分分析(PCA)，在對照組和OA組中均顯示出明顯的簇，兩組之間存在顯著差異

2.2鑒定具有統(tǒng)計意義的DEG：使用limma軟件包對比正常組與OA組滑膜組織中的DEG。見圖2所示，總共觀察到279個DEG，包括133個基因被上調和146個基因被下調。圖3顯示了所有上調和下調的DEG的熱圖。

注：紅點表示上調的基因，藍點表示下調的基因，黑點表示無統(tǒng)計學差異的基因

注：紅色表示較高的基因表達，藍色表示較低的基因表達

2.3DEG的GO和KEGG通路富集分析：見圖4所示，GO富集分析結果顯示，在生物學過程(GO-BP)上，DEGs主要富集在“免疫反應”，“細胞黏附”和“炎性反應”等；在分子功能(GO-MF)上，DEG主要通過調節(jié)“肝素結合”，“絲氨酸型內肽酶活性”和“抗原結合”發(fā)揮分子功能；在細胞組分上，DEG主要在“細胞外囊泡”，“細胞外區(qū)域”和“細胞外空間”中顯著富集。

圖4 DEG的前10個GO富集結果

DEG的KEGG通路富集分析結果見圖5所示，提示DEGs主要通過“類風濕性關節(jié)炎”，“TNF信號傳導途徑”，“破骨細胞分化”和“ECM-受體相互作用”等途徑發(fā)揮重要作用。

圖5 DEG的前20條KEGG通路富集分析結果

2.4PPI網(wǎng)絡構建和hub基因篩選：使用STRING數(shù)據(jù)庫構PPI網(wǎng)絡，并選擇相互作用評分>0.4的具有統(tǒng)計學意義的DEG在Cytoscape軟件中進行可視化處理，見圖6。排名前20位的hub基因包括細胞白介素(IL)-6，原始原癌基因(JUN)，CXC基序趨化因子配8(CXCL8)，血管內皮生長因子A(VEGFA)，核因子κB抑制劑α(NFKBIA)，基質金屬蛋白酶(MMP)1，MMP9等。表1列出了前20個hub基因的詳細信息。在這些基因中，IL-6，JUN和VEGFA具有最高的節(jié)點度，表明其在滑膜炎性反應過程中起關鍵作用。

表1 前20個hub基因的詳細信息

紅色表示較高程度的基因，黃色表示較低程度的基因

2.5子模塊分析:在PPI網(wǎng)絡中共鑒定出兩個MCODE分值>5且節(jié)點數(shù)>6的模塊。模塊1(MCODE分數(shù)=6.438)包括33個節(jié)點，模塊2(MCODE分數(shù)=5.111)包括10個節(jié)點。KEGG通路分析結果如圖7A和B所示，結果表明模塊中的DEG在“IL-17信號通路”，“ECM-受體相互作用”，“破骨細胞分化”，“NF-κB信號通路”中顯著富集。IL-17信號通路在兩個模塊中均顯著富集，提示其可能在OA發(fā)展過程中起關鍵作用。

圖7 DEG的子模塊的通路富集分析。

3 討論

隨著醫(yī)療技術的飛速發(fā)展，已將許多方法用于治療KOA，包括物理療法、非甾體類抗炎藥、關節(jié)鏡和關節(jié)置換術等。不幸的是，目前沒有辦法有效地逆轉或阻止KOA的進展[21]。全膝關節(jié)置換術(TKA)被認為是治療終末期KOA的最后選擇，但TKA也存在諸如感染、翻修、功能不滿意等并發(fā)癥[22-23]。因此，研究骨關節(jié)炎的發(fā)病機理并尋找治療KOA的有效方法一直是研究的重點。過去一般認為滑膜炎性反應被認為是由軟骨磨損導致的碎片引起的[24]。但是，最近的研究[25]顯示，滑膜炎性反應可以被認為是骨關節(jié)炎的先兆，在放射學檢查發(fā)現(xiàn)軟骨損傷之前就已經(jīng)存在。此外，有學者認為滑膜和脂肪膜下墊可被視為解剖功能單元，在KOA發(fā)生過程中加速軟骨損傷并引起疼痛[26]。因此，探索滑膜炎性反應的發(fā)病機制可能為KOA的治療提供新的視角。

本文納入了兩個GEO數(shù)據(jù)集，并使用生物信息學方法分析了279個DEG，包括133個上調基因和146個下調基因，并進行了GO和KEGG通路富集分析，以探索DEG在KOA進展過程中的生物學機制。KEGG通路富集分析結果顯示DEG主要在“類風濕關節(jié)炎”，“TNF信號途徑”，“PI3K-Akt信號途徑”和“破骨細胞分化”等通路富集，這與先前發(fā)表的文章相似[27-29]。GO富集結果顯示DEG主要富集在了“免疫反應”，“細胞黏附”和“炎性反應”等生物學過程。先前的研究表明，先天和后天免疫系統(tǒng)在OA過程中起關鍵作用[30]，并表明骨關節(jié)炎是一種炎性反應性疾病[31]。有趣的是，GO-CC分析結果顯示DEG主要富集在“細胞外囊泡”，“細胞外區(qū)域”和“細胞外空間”。外泌體是30-150 nm大小的細胞外囊泡，帶有脂質雙層膜，其中包含許多生物活性物質，如非編碼RNA、蛋白質和mRNA，在細胞間通訊中起重要作用[32-34]。這些DEG可以通過滑膜分泌到外泌體中，并被關節(jié)周圍的組織(如軟骨和脂肪墊)吸收，然后放大炎性反應并加重軟骨損傷，這進一步解釋了滑膜炎性反應在OA中的關鍵作用。

此外，本文構建了DEG的PPI網(wǎng)絡，并使用Cytoscape軟件進行可視化并根據(jù)自由度鑒定hub基因，結果顯示 IL-6，JUN和VEGFA具有最高的自由度。IL-6是一種炎性細胞因子，參與各種生物過程，包括炎性反應、免疫反應以及癌癥[35]。IL-6啟動子區(qū)的多態(tài)性引起歐洲人對類風濕性關節(jié)炎的易感性[36]，并與老年人骨關節(jié)炎的嚴重程度和功能狀態(tài)有關[37]。托珠單抗是一種IL-6抑制劑，可減輕OA引起的中樞敏化和慢性疼痛，并保留關節(jié)軟骨并增加骨量[38-39]。JUN是另一個hub基因，AP-1是JUN的激活蛋白，可以通過多種刺激調節(jié)，包括炎性細胞因子，氧化應激等[40]。許多MMPs啟動子包含潛在的AP-1結合位點，并且被細胞因子激活的AP-1也可以調節(jié)MMP表達。Tang等[41]提出c-JUN/AP-1信號通路調節(jié)人滑膜成纖維細胞中IL-6的表達。VEGFA是VEGF家族的創(chuàng)始成員，通常被稱為VEGF[42]。VEGF在骨骼發(fā)育和骨重構中起著調節(jié)血管生成的關鍵作用，并被懷疑在OA的發(fā)病機理中起著關鍵作用[43]。膝關節(jié)內注射VEGF可誘導OA樣變化，如關節(jié)軟骨降解、蛋白聚糖丟失、滑膜炎性反應以及軟骨下硬化[44]。臨床證據(jù)表明VEGF水平升高與OA進展有關[42,45]。最近的臨床前研究也顯示抑制VEGF可有效預防OA的關節(jié)破壞并減輕相關疼痛[42]。

最后，PPI網(wǎng)絡的子模塊分析表明，OA的發(fā)展與“IL-17信號通路”，“ECM-受體相互作用”，“破骨細胞分化”，“NF-κB信號通路”等相關。IL-17信號通路在這兩個模塊中都顯著富集，提示其可能在OA過程中起關鍵作用。IL-17主要由Th17細胞產(chǎn)生，Th17細胞是CD4+T細胞的一個亞群，主要參與誘導自身免疫和炎性疾病[46]。Liu等[47]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，IL-17在OA中的表達明顯更高患者，并阻斷IL-17信號通路可延遲與OA相關的疼痛。同時，IL-17信號通路可以激活NF-kB和MAPK通路，而這些通路與OA的發(fā)展密切相關[48]?；|金屬蛋白酶(MMPs)是一種促進軟骨分解，降解細胞外基質(ECM)成分并在OA中起重要病理作用的酶家族[49]。許多文章使用MMPs的表達水平來反映OA中軟骨損傷的程度，尤其是MMP-1、-3和-9[50-52]。PTGS2是與炎性反應相關的基因，在骨關節(jié)炎中高度相關[53]。NFKBIA、FOSB和JUND都與NF-kB和MAPK信號通路密切相關，它們在OA的病理過程中起著至關重要的作用[54-55]。

綜上所述，本研究在OA滑膜炎性反應過程中鑒定出279個DEG，這些DEG顯著富集在“風濕性關節(jié)炎”，“TNF信號傳導途徑”，“PI3K-Akt信號傳導途徑”和“破骨細胞分化”等通路。GO-CC的結果提示滑膜將DEGs釋放至外泌體，在KOA的信號傳遞中起關鍵作用，并加劇KOA進展。IL-17信號通路可能是治療KOA的重要靶標。