陳健芬 宋云云 孫東方 張莉慧

(1.蘇州市金茂日用化學品有限公司，江蘇 蘇州 215341；2.江蘇大學，江蘇 鎮(zhèn)江，212013；3.黑龍江省輕工科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150010)

引言

口腔疾病的發(fā)生與口腔致病菌的粘附定殖以及生物膜的形成密切關聯(lián)[1,2]。尤其是致病菌形成的生物膜，對外界環(huán)境有很強的適應性[3]?？谇恢虏【粌H能夠引起口腔微生態(tài)失衡，從而誘發(fā)口腔疾病，也是阿爾茨海默癥、肺炎、腫瘤和糖尿病等疾病的誘發(fā)因素之一[4]。伴放線放線桿菌是一種具有高致病潛力的革蘭氏陰性口腔致病細菌，易在口腔中滋生定殖形成結構復雜的牙菌斑生物膜，引發(fā)牙周病[5]。另外，伴放線放線桿菌能夠分泌合成多種高毒力因子，引起牙周炎的發(fā)生和發(fā)展，進而造成牙齦出血，牙齒松動、口臭等癥狀[6,7]。有研究報道，伴放線放線桿菌與胃癌、白血癥等病癥也有一定相關性[8,9]。近年來，運用益生菌預防和治療口腔疾病受到越來越多的關注[10,11]。相比于傳統(tǒng)的機械療法及藥物療法，益生菌能夠起到調節(jié)口腔微生態(tài)平衡、抑制生物膜以及破壞致病菌毒力等作用[12]。

茶多酚作為綠色無污染的天然抑菌劑在食品中應用廣泛?，F(xiàn)有研究表明茶多酚對口腔致病菌有抑制作用，目前已經廣泛用于牙膏產品中[13,14]。然而，將茶多酚與益生菌復配使用對抑制口腔致病菌的協(xié)同抑菌機理研究目前未見報道。因而探索研究益生菌和茶多酚的最佳復配比例，建立在口腔清潔護理用品中運用的益生菌和茶多酚的復配抑菌模型，通過研究伴放線放線桿菌的降低量和生物膜抑制量等特性指標，多維度地評價益生菌和茶多酚的復配抑菌模型對致病菌的抑制效能，探索益生菌與茶多酚復配抑菌模型對口腔致病菌抑菌作用的科學有效性。

益生菌改善口腔健康主要是通過與口腔致病菌競爭結合位點，阻礙致病菌的定殖，從而使致病菌從口腔中排出。益生菌產生的代謝物質，如有機酸、細菌素等，能夠有效抑制致病菌的生長以及生物膜的形成[15]。有研究表明將益生菌進行滅活處理后仍可對機體發(fā)揮相應的功效，且效果優(yōu)于活菌[16,17]。副干酪乳桿菌是口腔微生物群中最常見的乳桿菌，其滅活菌粉能與口腔致病菌產生凝聚沉淀[18]。有研究同時表明益生菌與致病菌共凝聚能力與益生菌的疏水性有很大關系，可能是因為菌體表層蛋白影響了菌體表面性質[19]。茶多酚能夠抑制口腔致病菌生物膜的形成，通過破壞細菌膜和細菌壁、抑制核酸合成等方式殺死致病菌，而且能夠抑制致病菌產生有害代謝產物及促炎相關基因表達[20]。然而，益生菌滅活菌粉對口腔致病菌的共凝聚機理目前尚不清楚，且益生菌與茶多酚復配后對口腔致病菌的協(xié)同抑菌機理研究未見有報道。

因此，本研究探索性地運用多種材料學和生物化學相關理論與專業(yè)知識相結合的手段，可量化地探測益生菌和致病菌的表面形態(tài)、化學組分、菌體表面電荷和表面粗糙度等微觀動態(tài)。傅里葉近紅外光譜檢測結果表明了益生菌與致病菌表面同時具有-CH2-和-CH3低表面能官能團，具有相似低表面能基團的益生菌和致病菌會發(fā)生共凝聚。同時益生菌表面粗糙度為Ra=19.5nm，比伴放線放線桿菌表面更粗糙，因此益生菌粘附作用更強，在口腔內能與致病菌競爭粘附位點從而減少致病菌數(shù)量。茶多酚具有殺菌作用，通過益生菌的共凝聚與茶多酚的殺菌雙重特性，達到顯著抑制伴放線放線桿菌滋生的目的。據(jù)此發(fā)現(xiàn)并分析研究益生菌與天然茶多酚協(xié)同對伴放線放線桿菌的抑菌機理。比對益生菌、茶多酚單獨添加以及益生菌和茶多酚復配抑菌模型在牙膏中對3種常見致病菌(伴放線放線桿菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌)的抑菌作用結果的差異性，為益生菌干粉復配茶多酚抑菌模型在牙膏等口腔清潔護理用品中的應用，提供充分的理論依據(jù)與運用技術的支撐。

1 方法與結果

1.1 材料與分析

1.1.1 試劑與儀器

選用現(xiàn)牙膏中常用的兩款益生菌：副干酪乳桿菌干粉、復合益生菌干粉(嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、唾液乳桿菌)；血平板和0.5%結晶紫染色液購于常德比克曼生物科技有限公司，2.5 L厭氧罐C-31、二氧化碳產氣袋C-3和厭氧產氣袋購于上海創(chuàng)凌生物科技有限公司；LIVE/DEAD? BacLightTM細菌活性檢測試劑盒7012購于陜西捷科達科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(pH=7.2～7.4)、2.5%戊二醛固定液(分析純)、氯化鈉(分析純)、茶多酚(95%)購于國藥集團化學試劑有限公司，牙膏樣品由蘇州市金茂日用化學品有限公司提供。

菌液制備：本試驗中選用的伴放線放線桿菌ATCC 29523購自廣東省科學院微生物研究所，使用血平板培養(yǎng)基(TSA+5%脫纖維蛋白羊血)進行培養(yǎng)，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48h，用磷酸緩沖鹽液(PBS，pH=7.2～7.4)調節(jié)菌體濃度至 1×109CFU/mL備用。

主要儀器設備如表1所示。

表1 主要儀器

1.1.2 數(shù)據(jù)分析

試驗中，使用SPSS 18.0軟件以 5%的顯著性水平對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)表達形式為平均值±標準偏差，所有試驗均設置3個重復試驗。

1.2 建立益生菌和茶多酚復配抑菌模型

1.2.1 確定益生菌最佳有效添加量

通過測定兩種益生菌干粉產品的抑菌性能，以選取抑菌效果勝出的益生菌。采用Lv等[21]所用的牛津杯雙層平板法，首先配置濃度為0.02g/mL的副干酪乳桿菌和復合益生菌菌液。配置含100μL伴放線放線桿菌菌液(濃度約為1×109CFU/mL)的血平板(TSA+5%脫纖維蛋白羊血)，吸取100μL制備好的益生菌菌液加入牛津杯孔中，培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)48h后測量抑菌圈直徑。

同時，通過共凝聚試驗方法進一步測定益生菌對伴放線放線桿菌的作用效果。在Arellano-Ayala和Fadare等[22,23]所用的方法基礎上進行優(yōu)化：將副干酪乳桿菌益生菌干粉和復合益生菌干粉配置成濃度為0.02g/mL的菌液，分別與制備好的伴放線放線桿菌菌懸液按照1∶1體積混合，靜置0.5h和1h后輕輕吸取100μL上清液，用十倍稀釋法稀釋，吸取100μL不同比例的稀釋液涂布，37℃下培養(yǎng)48h后計數(shù)。最后，通過比較抑菌圈直徑以及伴放線放線桿菌降低量，選出作用效果較好的益生菌進行下一步試驗，試驗重復3次。

結果顯示：相同濃度下，副干酪乳桿菌與復合益生菌對伴放線放線桿菌的抑制作用沒有顯著差異(表2)，但是抑菌效果均明顯小于茶多酚(P<0.05)。如圖1所示，將濃度均為0.02g/mL的副干酪乳桿菌和復合益生菌與伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合放置0.5h后，伴放線放線桿菌的降低量沒有顯著差異(P>0.05)。放置1h后，經副干酪乳桿菌處理后的伴放線放線桿菌降低量為0.22±0.02 Log10CFU/mL，顯著高于復合益生菌作用后伴放線放線桿菌的降低量(0.17±0.02 Log10CFU/mL)，(P<0.05)。據(jù)此，選用副干酪乳桿菌進行下一步研究。

表2 不同物質對伴放線放線桿菌的抑制作用

不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，P<0.05。

將篩選出的益生菌(副干酪乳桿菌)干粉按照0.3%、0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%和4%(m/v)的添加量用PBS緩沖液配置成不同濃度的益生菌溶液。按照上述方法操作，通過比較靜置1h后伴放線放線桿菌的菌落降低量選出合適的益生菌添加量，試驗重復3次。

結果表明：將不同濃度的副干酪乳桿菌與伴放線放線桿菌混合作用1h后，當益生菌添加量小于1.0%(0.01g/mL)時，伴放線放線桿菌的降低量沒有顯著差異(P>0.05)，隨著益生菌濃度增高，伴放線放線桿菌的降低量增加(圖2)。然而，當益生菌添加量大于3.0%(0.03g/mL)時，伴放線放線桿菌的降低量逐漸減少。因此，副干酪乳桿菌最適的添加量范圍為1.0%～3.0%。

不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，P<0.05。

1.2.2 建立益生菌和茶多酚最佳抑菌模型

測定茶多酚對伴放線放線桿菌的最小抑菌濃度(MIC)，配置濃度為0.02g/mL的茶多酚溶液，按照兩倍稀釋法稀釋[24]，與伴放線放線桿菌的菌懸液按照1∶1的比例混合，置于96孔板中于37℃培養(yǎng)48h，以肉眼觀察無細菌生長為最小抑菌濃度。結果表明：茶多酚的最小抑菌濃度(MIC)為 2.5mg/mL。

另外，按照副干酪乳桿菌的添加量為1%配置益生菌溶液，配置最小抑菌濃度的茶多酚溶液，與益生菌溶液按2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例混合，之后與伴放線放線桿菌的菌懸液按照1∶1的比例混合，靜置1h, 輕輕吸取上清進行計數(shù)，陽性對照為添加等量的益生菌或茶多酚，陰性對照為添加等量的PBS緩沖液。通過比較伴放線放線桿菌的降低量確定益生菌與茶多酚的最佳比例，試驗重復3次。

結果表明：當益生菌(0.01g/mL)和最小抑菌濃度的茶多酚比例為2∶1時，茶多酚和益生菌協(xié)同作用下伴放線放線桿菌的降低量顯著高于單獨的益生菌或茶多酚(圖3)。另外，隨著茶多酚量的增加，茶多酚作用后伴放線放線桿菌的降低量顯著增加，這是因為茶多酚具有殺菌作用[25]，隨著茶多酚濃度增加，茶多酚和益生菌復配以后的抑菌效果低于單獨的茶多酚。這和上述益生菌和茶多酚的抑菌試驗結果一致，進一步表明益生菌的抑菌作用主要依靠共凝聚作用，而茶多酚依靠殺菌作用抑制伴放線放線桿菌的生長。因此，益生菌和茶多酚最佳抑菌模型為益生菌(0.01g/mL)和茶多酚比例為2∶1。

不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，P<0.05)。

1.3 益生菌和茶多酚復配抑菌模型的抑菌機理研究

1.3.1 對伴放線放線桿菌生物膜量分析測定

參照秦蘇佳和Phumat等[26,27]采用的方法，對伴放線放線桿菌生物膜量作分析測定。用TSB液體培養(yǎng)基配置最佳配比的益生菌和茶多酚溶液，將配置的益生菌、茶多酚以及益生菌和茶多酚最佳復配模型溶液吸取100μL置于96孔板中，與100μL的伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合。陰性對照為TSB培養(yǎng)基與伴放線放線桿菌菌懸液按照等比例混合，37℃下培養(yǎng)48h。之后吸取出培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍，加入50μL濃度為0.5%的結晶紫避光染色15min，洗滌晾干后用200μL 95%乙醇溶解結晶紫，用酶標儀在OD595nm下測吸光度，試驗重復三次。生物膜抑制率計算公式為：

牙菌斑生物膜是引起牙周炎的初始因素，抑制致病菌生物膜的形成能夠有效治療牙周病[28]。通過生物膜形成量的測定，可知益生菌和茶多酚均能有效抑制致病菌生物膜的形成，抑制率分別達到62.3%和61.4%(圖4)。益生菌和茶多酚最佳配比抑菌模型對伴放線放線桿菌生物膜量的抑制率上升為71.7%，顯然高于單獨益生菌或茶多酚的抑制率(圖4)。

不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，P<0.05。

1.3.2 掃描電鏡形貌分析

利用掃描電鏡觀察用益生菌和茶多酚處理后伴放線放線桿菌細胞表面形態(tài)。參考Song等[29]描述的方法，將益生菌和茶多酚最佳配比抑菌模型與伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合，靜置1h后棄去上清。陽性對照為添加等量益生菌或茶多酚，陰性對照為添加等量的PBS緩沖液。處理組和對照組的菌體沉淀用2.5%戊二醛4℃過夜固定，接著用PBS(0.1mol/L，pH=7.2)清洗兩次，然后用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水，最后干燥噴金并進行形態(tài)觀察。

如圖5a所示，單獨的伴放線放線桿菌菌體比較完整，表面較為平整。大部分益生菌菌體完整，少部分菌體有輕微凹陷(5b)，分析是因為益生菌制備成干粉時，對菌體有部分損傷。然而，單獨的益生菌和伴放線放線桿菌菌落分散或者單純疊加一起，沒有共凝聚現(xiàn)象。經過益生菌處理以后，益生菌和致病菌菌體粘連一起，表明益生菌與致病菌菌體之間產生共凝聚現(xiàn)象(圖5c)。而茶多酚處理以后，菌體表面變得凹凸不平，有部分菌體破裂，細胞內物質流出(圖5d)，說明茶多酚對致病菌具有殺菌作用，破壞了細菌細胞完整性[30]。當益生菌和茶多酚協(xié)同作用時，既能觀察到共凝聚現(xiàn)象，也有細菌破裂的現(xiàn)象(圖5e)。掃面電鏡結果進一步證實了抑菌試驗結果，說明益生菌對伴放線放線桿菌主要為共凝聚作用，加入茶多酚以后，其殺菌作用能夠提高益生菌對伴放線放線的抑菌作用。

a，伴放線放線桿菌；b，益生菌；c，益生菌+伴放線放線桿菌；d，茶多酚+伴放線放線桿菌；e，益生菌：茶多酚(2∶1)+伴放線放線桿菌。

1.3.3 菌體表面電荷測定

將益生菌和茶多酚最佳抑菌模型與伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合，靜置1h后棄去上清，得到的菌體沉淀用PBS(pH=7.2～7.4)重新溶解后用zeta電位儀測定菌體表面電荷。陽性對照為添加等量的益生菌或茶多酚，陰性對照為添加等量PBS緩沖液的益生菌和伴放線放線桿菌。

細菌表面電荷較高時會提供排斥力，增加細胞的穩(wěn)定性。當zeta電位絕對值減小時，細胞之間因為排斥力下降而發(fā)生凝聚沉積作用[31]。表3結果表明：益生菌與伴放線放線桿菌作用以后，zeta電位絕對值下降，說明菌體之間發(fā)生了共凝聚作用。另外，益生菌與茶多酚協(xié)同作用以后，zeta電位絕對值降低，降低量小于單獨的益生菌作用效果，這與茶多酚殺菌作用使得伴放線放線桿菌細胞破裂，細胞質及細胞內離子等物質流出，從而影響菌體表面電位值有關聯(lián)。

表3 不同處理下菌體表面電荷的變化

1.3.4 傅里葉近紅外光譜測定菌體表面成分

參照Song等[32]采用的紅外光譜技術測定細菌表面官能團的變化，具體方法為：益生菌和茶多酚最佳抑菌模型與伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合，靜置1h后棄去上清，得到的菌體沉淀用PBS(pH=7.2～7.4)重新溶解后用傅里葉近紅外光譜儀測定。陽性對照為添加等量的益生菌或茶多酚，陰性對照為添加等量的PBS緩沖液。

由以上結果可知，益生菌抑制伴放線放線桿菌主要依靠共凝聚作用。通過傅里葉紅外光譜測定可知(圖6)，益生菌在2855cm-1處觀察到的峰值屬于-CH2-官能團，-CH3官能團在2920cm-1處產生峰值。眾所周知，表面能為24 mJ m-2的-CH3基團和表面能為31 mJ m-2的-CH2-基團都具有較低的表面能，這在疏水性聚合物中非常豐富。伴放線放線桿菌表面也同時具有-CH2-和-CH3官能團。因此具有相似低表面能基團的益生菌和伴放線放線桿菌會發(fā)生共凝聚，二者共凝聚后未測出-CH2-和-CH3基團，說明含有低表面能基團的位點由于物質共凝聚被遮擋，紅外光譜只能檢測表面官能團，難以準確測定物質內部基團。而茶多酚和伴放線放線桿菌共凝聚后依然能檢測出-CH2-和-CH3基團，說明二者共凝聚不是由于低表面能官能團，而是靜電吸附作用。

a，益生菌；b，致病菌；c，益生菌和致病菌共凝聚；d，茶多酚和致病菌共凝聚。

1.3.5 細菌表面粗糙度測定

細菌表面粗糙度與細菌粘附力大小有關。除了表面成分，本研究進一步從表面結構上分析了共凝聚機理。配置濃度為0.02g/mL益生菌溶液，參考Sandin等和韋蕾[33,34]所用的方法測定細菌表面粗糙度。具體方法為：將益生菌溶液與伴放線放線桿菌(109CFU/mL)菌液分別用2.5%戊二醛固定30min，隨后取5μL滴在云母片上，自然晾干后用原子力顯微鏡測定兩株細菌表面粗糙度。

圖7a和c是致病菌的2D原子力顯微鏡光學圖片和3D粗糙度輪廓圖。致病菌表面的平均面粗糙度Ra=11.5 nm；圖7b和d是益生菌的2D原子力顯微鏡光學圖片和3D粗糙度輪廓圖。益生菌表面的平均面粗糙度Ra=19.5nm。益生菌比伴放線放線桿菌菌體表面更為粗糙，結果表明益生菌粘附作用更強，在口腔內能與致病菌競爭粘附位點，減少致病菌的粘附。

(a, 致病菌；b，益生菌)和3D粗糙度輪廓圖(c, 致病菌；d，益生菌)。

因此綜合上述分析，益生菌和茶多酚的協(xié)同抑菌機理如圖8所示，共有的疏水基團導致益生菌和致病菌發(fā)生共凝聚，將致病菌從牙面上帶走，同時天然抑菌物質茶多酚也能夠輔助殺死致病菌，與益生菌起到協(xié)同抑菌的增強疊加效應。

圖8 益生菌和茶多酚的協(xié)同抑菌機理示意圖

1.4 益生菌與茶多酚復配抑菌模型在牙膏中抑菌作用評價

1.4.1 試驗方法

為了評價益生菌與茶多酚在牙膏中對致病菌的抑菌效果，將益生菌與茶多酚按照最佳配比加入牙膏中。除了伴放線放線桿菌 ATCC 29523，同時選取變異鏈球菌CGMCC 12499和具核梭桿菌ATCC 25586，兩株菌均由江蘇大學食品學院提供，將兩株菌接種于血平板上，置入含有80%N2、10%H2、10%CO2的厭氧袋中37℃培養(yǎng)48h，調節(jié)菌體濃度為109CFU/mL。采用高鷹等[18]的方法稀釋牙膏樣品，具體方法為：稱取0.5g牙膏溶于1mL PBS(pH=7.2～7.4)溶液中，充分振蕩溶解，去除溶液中氣泡。之后分別與三株致病菌菌懸液按照1∶1比例混合，靜置培養(yǎng)1h后輕輕吸取上清進行涂布計數(shù)，陽性對照為添加等量的益生菌或茶多酚牙膏，陰性對照為未添加益生菌和茶多酚的牙膏。通過檢測致病菌降低量來評價益生菌與茶多酚復配抑菌模型在牙膏中的抑菌效果，試驗重復三次。

1.4.2 試驗結果

表4為益生菌、茶多酚單獨添加以及益生菌和茶多酚復配抑菌模型在牙膏中對口腔常見三種致病菌的作用結果。牙膏中添加益生菌或者茶多酚后，其抑制作用均有不同程度的增強(表4)，并具顯著性差異。將益生菌與茶多酚復配抑菌模型運用在牙膏中，與單獨添加益生菌或茶多酚的牙膏相比，能夠進一步提升致病菌的降低量。從而更有效地發(fā)揮抑制口腔常見牙周炎等致病菌的功效作用。

表4 不同物質在牙膏中對伴放線放線桿菌的抑制作用

2 討論與結論

2.1 口腔致病菌會引發(fā)牙周炎等多種疾病，在牙膏等產品中添加益生菌用于預防口腔疾病受到越來越多的關注[35]。本研究選用的副干酪乳桿菌能與伴放線放線桿菌產生共凝聚作用，減少致病菌在口腔中的定殖。當與茶多酚協(xié)同作用時，不僅能夠與致病菌產生共凝聚作用，還能夠起到殺滅致病菌的作用。

2.2 本研究通過運用多種材料學和生物化學手段，可量化地觀測益生菌和致病菌的表面形態(tài)、化學組分和表面粗糙度，多維度分究并闡明了益生菌與茶多酚對伴放線放線桿菌的抑菌機理：通過SEM形貌觀測結果和菌體表面zeta電位絕對值的下降,表明益生菌對伴放線放線桿菌主要為共凝聚作用；傅里葉近紅外光譜結果更進一步說明了益生菌與致病菌表面同時具有-CH2-和-CH3低表面能官能團，具有相似低表面能基團的益生菌和致病菌會發(fā)生共凝聚；益生菌表面粗糙度為Ra=19.5nm，比致病菌表面更粗糙，因此益生菌粘附作用更強，在口腔內能與致病菌競爭粘附位點從而減少致病菌數(shù)量。添加茶多酚后，菌體表面變得凹凸不平，有部分菌體破裂，細胞內物質流出，破壞了細菌細胞完整性，其殺菌作用能提高益生菌對伴放線放線的抑菌作用。研究建立的益生菌和茶多酚復配抑菌模型，通過共凝聚和殺菌雙重協(xié)同作用，對伴放線放線桿菌生物膜量的抑制率可上升至71.7%，明顯高于單獨益生菌或茶多酚的抑制率。

2.3 將建立的益生菌與茶多酚復配抑菌模型運用在牙膏中，同時與單獨添加益生菌或茶多酚的牙膏比對，益生菌與茶多酚復配抑菌模型對口腔常見的三株致病菌(伴放線放線桿菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌)的抑菌作用增強。由此可見，益生菌協(xié)同茶多酚具有顯著的口腔益生特性。為日后進一步探究益生菌等天然微生態(tài)抑菌成分在口腔清潔護理用品中對口腔致病菌的抑菌作用機理，提供了可靠的方法依據(jù)與研究思路。