陶維平，彭 亞，李湘勝

(湖南省長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院耳鼻喉科 410006)

鼻咽癌是指發(fā)生在鼻咽部的惡性腫瘤，現(xiàn)在的人們生活和工作壓力、環(huán)境污染均比較大，導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)病率較高[1-2]。癥狀在早期多不典型，隨著腫瘤的生長(zhǎng)，逐步出現(xiàn)一系列的癥狀，如鼻出血、頭疼，鼻咽癌也可以出現(xiàn)耳悶、鼻塞、鼻涕中帶血的情況，比較嚴(yán)重的情況就會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、視力障礙、呼吸困難等，對(duì)身體的影響較大，使患者備受折磨。鼻咽癌和顱內(nèi)相通，易導(dǎo)致顱內(nèi)的損傷和感染，若不及早進(jìn)行治療會(huì)危及生命[3-4]。目前對(duì)于鼻咽癌首選的治療方法為放射治療，根治性的治療多適用于全身狀況良好的患者。據(jù)報(bào)道，膜聯(lián)蛋白A7(AnnexinA7)、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)、人類白細(xì)胞抗原F(HLA-F)在體內(nèi)參與多種生理病理過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，調(diào)控血管生成等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在部分腫瘤如肺癌、直腸癌、乳腺癌等組織中高表達(dá)，并在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用。但是，AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌組織中表達(dá)情況及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響尚未明確[5-6]。本文旨在通過(guò)分析AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平，以為AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌的研究提供依據(jù)和方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年4月至2021年3月于本院進(jìn)行手術(shù)治療的鼻咽癌患者78例，其中男41例，女37例，年齡28～85歲，平均(56.5±22.8)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)X射線、CT檢查黏膜下的組織有早期病變；(2)鼻咽部有腫物,腫物活檢證實(shí)為癌變；(3)臨床病歷資料齊全；(4)無(wú)全身感染及嚴(yán)重貧血；(5)無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期接受放化療；(2)患有嚴(yán)重高血壓、心臟病者；(3)肝、腎功能障礙者；(4)合并器官腫瘤者；(5)精神異常，不能積極配合溝通治療者。取患者術(shù)中切除的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm之內(nèi)的非癌組織)行免疫組織化學(xué)(IHC)染色，根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版分期標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)類型中非角化型癌30例，角化型癌48例；T分期中T1期24例，T2～4期54例；N分期中N0期21例，N1～3期57例；臨床綜合分期中Ⅱ期7例，Ⅲ期31例，Ⅳ期40例。本研究患者及家屬均知情同意，并獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2020倫審第(65)號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集及IHC染色

所有癌組織、癌旁組織5 μm厚度切片，行常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0，0.01 mol/L)95 ℃加熱30 min，取出冷卻，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗。滴加0.3%過(guò)氧化氫阻斷劑，4%脫脂奶粉，恒溫孵育30 min后PBS清洗3次，滴加山羊血清，26 ℃環(huán)境中培養(yǎng)0.5 h，添加一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，取出后PBS清洗，滴加二抗兔抗羊IgG(1∶1 000)，再次孵育30 min，再與抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育30 min，使用PBS清洗，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色處理8 min，蘇木精染色，反藍(lán)、脫水處理后封片，顯微鏡觀察(200倍)，使用ImageJ軟件分析AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)的積分光密度值。

1.2.2IHC染色檢測(cè)AnnexinA7、ERCC1、HLA-F的表達(dá)水平

將鼻咽癌組織切片放置60 ℃烤箱，拷片2 h，使用二甲苯反復(fù)脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇水化，用蒸餾水沖洗5 min。將切片放置塑料染色架上，放入含0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸組織抗原緩沖液容器中，加熱15～20 min，冷卻。蒸餾水沖玻片洗2次，PBS沖洗3次。過(guò)氧化物酶阻斷劑15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。稀釋滴加1滴一抗(1∶1 000稀釋)，放入4 ℃冰箱保存；次日取出放置30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，切片滴加50 μL MaxVisionTM試劑，40 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，切片滴加DAB顯色試劑顯色。3～5 min后沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，沖洗反藍(lán)。梯度乙醇脫水，二甲苯透明10 min，風(fēng)干，封片，顯微鏡觀察(200倍)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在兩組標(biāo)本組織中的表達(dá)水平比較

IHC染色結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中陽(yáng)性染色細(xì)胞陽(yáng)性顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)，癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

A:AnnexinA7;B:ERCC1;C:HLA-F。

表1 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在兩組組織標(biāo)本中的表達(dá)水平比較

2.2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F與鼻咽癌臨床病理因素的關(guān)系

AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在不同性別、年齡的鼻咽癌中表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在不同組織學(xué)類型及T、N分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Ⅱ期鼻咽癌患者比較，Ⅲ、Ⅳ期管鼻咽癌患者AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與Ⅲ期鼻咽癌患者比較，Ⅳ期管鼻咽癌患者AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F與鼻咽癌臨床病毒因素的關(guān)系

續(xù)表2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F與鼻咽癌臨床病毒因素的關(guān)系

2.3 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的預(yù)測(cè)價(jià)值

與AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一指標(biāo)檢測(cè)比較，AnnexinA7、ERCC1、HLA-F聯(lián)合檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的預(yù)測(cè)價(jià)值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3、圖2。

表3 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)鼻咽癌的ROC曲線圖

2.4 鼻咽癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)水平相關(guān)性分析

對(duì)鼻咽癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。鼻咽癌組織中AnnexinA7與ERCC1、HLA-F表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.537、0.652，P=0.001)；ERCC1與HLA-F表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.479，P=0.001)，見表4。

表4 鼻咽癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)水平相關(guān)性分析

3 討 論

鼻咽癌是臨床上很常見的一種惡性腫瘤，主要發(fā)生的部位是鼻咽，多發(fā)生于南方地區(qū)。目前發(fā)病原因并不是很清楚，通常跟EB病毒感染、遺傳、環(huán)境等因素有一定的聯(lián)系[7-8]。鼻咽癌發(fā)生位置有些隱蔽，早期不易發(fā)現(xiàn)，只有通過(guò)定期檢查才能發(fā)現(xiàn)。鼻咽癌對(duì)放療最敏感，早期的鼻咽癌甚至有治愈的可能，但局部病灶復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致死亡及預(yù)后欠佳的關(guān)鍵因素。因此，尋找一種針對(duì)鼻咽癌患者的診治及預(yù)后判斷相關(guān)的標(biāo)志蛋白是臨床重要研究方向[9-10]。

AnnexinA7基因定位于人類染色體，是一種可促進(jìn)膜融合、黏著的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，受三磷酸鳥苷(GTP)酶的調(diào)控[11]。有研究顯示，AnnexinA7在喉癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤呈高表達(dá)，在疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中占據(jù)重要角色[12-13]。葉衛(wèi)華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinA7在胃癌中表達(dá)下調(diào)可明顯抑制癌細(xì)胞增殖，具有抑癌作用，其蛋白表達(dá)水平與胃癌的預(yù)后不良具有密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，AnnexinA7在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，與T、N分期明顯相關(guān)(P<0.05)，且高分期癌組織表達(dá)相對(duì)較高，與其在胃癌組織中表達(dá)相似，提示AnnexinA7可促進(jìn)多種蛋白的表達(dá)，可能激活了Ras-Raf-MAPK相關(guān)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡，且其表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等病理特征具有一定相關(guān)性，進(jìn)而影響參與鼻咽癌發(fā)生演進(jìn)。

ERCC1是核酸切除修復(fù)家族中重要的基因，具有識(shí)別DNA鏈切割、損傷的雙重功能，其表達(dá)水平可直接影響DNA修復(fù)的生理過(guò)程[15]。有研究顯示，ERCC1表達(dá)異?？赡苡绊懕茄拾┗颊呋熕幬锆熜В渫ㄟ^(guò)蛋白表達(dá)作用于基因改變[16-17]。鼻咽癌組織中ERCC1表達(dá)的相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，研究結(jié)果具有偏倚，與選取樣本及地域不同、樣本量較少有關(guān)。有研究表明，ERCC1在鼻咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織，并認(rèn)為ERCC1表達(dá)異常及癌變可能與DNA修復(fù)酶基因作用在上皮細(xì)胞形成內(nèi)積聚體有關(guān)[18]。本研究顯示，鼻咽癌ERCC1呈現(xiàn)異常表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，鼻咽癌組織中ERCC1表達(dá)水平明顯增高(P<0.001)；在臨床綜合分期中，其臨床分期越晚，ERCC1表達(dá)水平越高。

HLA-F是HLAⅠ類分子重要成員之一，在T淋巴細(xì)胞、腫瘤、先天免疫細(xì)胞表面表達(dá)中的消耗起著重要作用。研究顯示，HLA-F的表達(dá)具有廣泛性，在除絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞外的所有有核細(xì)胞表面都有表達(dá)，在不同腫瘤類型如肝癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌中也均有表達(dá)，且其在不同腫瘤中表現(xiàn)出了不同的臨床相關(guān)性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了不同程度的推動(dòng)作用[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F在鼻咽癌中的表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立因子，且HLA-F表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)程度、血管及淋巴管侵犯、轉(zhuǎn)移等相關(guān)[2]。本研究顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量增多鼻咽癌癌組織中HLA-F表達(dá)相對(duì)較高，說(shuō)明HLA-F的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定相關(guān)性，其可作為診斷鼻咽癌患者的生物標(biāo)志物。

綜上所述，本文通過(guò)對(duì)AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌組織中表達(dá)及臨床意義的研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達(dá)水平與鼻咽癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分級(jí)相關(guān)，且三者的異常表達(dá)，可能共同參與鼻咽癌發(fā)展演進(jìn)過(guò)程，對(duì)鼻咽癌的診斷有一定的臨床價(jià)值。但本研究由于選取病例數(shù)較少，具有局限性，故在下一步研究中，可擴(kuò)大研究范圍、增加樣本量，進(jìn)一步探究AnnexinA7、ERCC1、HLA-F的表達(dá)變化及臨床意義。