張博汝，魏 柏，石曉雅，謝夢(mèng)麗

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院腫瘤科，武漢 430077)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在全球發(fā)病率和病死率分別位于惡性腫瘤的第三和第二，對(duì)人類(lèi)的健康造成威脅[1]。放療是結(jié)直腸癌治療的重要手段之一，因此，提高結(jié)直腸癌對(duì)放療的敏感性對(duì)降低患者的病死率和改善預(yù)后至關(guān)重要。腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白1(Bmal1)基因是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的重要轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞中，Bmal1基因可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、衰老、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的應(yīng)激恢復(fù)、逃避凋亡等，作為一種可能的致癌基因,通過(guò)DNA損傷修復(fù)途徑、細(xì)胞遷移、缺氧、全身免疫應(yīng)答，促進(jìn)化療耐藥性或轉(zhuǎn)移[2-4]。然而關(guān)于節(jié)律基因Bmal1能否影響結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性尚少見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)體外細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，旨在觀察Bmal1基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響及其可能作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞由華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心饋贈(zèng)。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：8120473)，胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司(批號(hào)：2120140)，胰蛋白酶(批號(hào)：70080500)、青霉素鏈霉素溶液(批號(hào)：88100500)購(gòu)自Biosharp公司，Bmal1 siRNA和陰性對(duì)照negative control siRNA由武漢奇景生物科技有限公司合成，HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Qiagen公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自賽文創(chuàng)新生物科技有限公司(批號(hào)：20210102)，RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，Bmal1、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、GAPDH引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司，RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物公司，兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體(批號(hào)：161802)、兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗體(批號(hào)：AC2103033E)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(批號(hào)：CR2104081)購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司，兔抗小鼠Bmal1多克隆抗體(批號(hào)：00011253)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(批號(hào)：4000003012)購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

結(jié)直腸癌細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為60%～70% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作步驟按照HiPerFect Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將轉(zhuǎn)染Bmal1 siRNA細(xì)胞記為敲除組，將轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 negative control siRNA的細(xì)胞記為對(duì)照組。siRNA Bmal1序列，上游引物：5′-CCG AGG GAA GAU ACU CUU UTT- 3′；下游引物：5′-AAA GAG UAU CUU CCC UCG GTC-3′。

1.2.2細(xì)胞X射線照射實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于6孔板中，進(jìn)行放射處理。用直線加速器，照射源至細(xì)胞培養(yǎng)板的距離為100 cm，照射野的面積為10 cm×10 cm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要給予合適的射線劑量，6MV X射線，總劑量6 Gy照射處理。把細(xì)胞分為對(duì)照組、Bmal1基因敲除組(敲除組)、放療組、Bmal1基因敲除聯(lián)合放療組(聯(lián)合組)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力

各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)照射后，吸去6孔板中舊培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用1 mL完全培養(yǎng)液重懸，反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，取10 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔吸取1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以細(xì)胞貼壁為0 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)每孔細(xì)胞光密度(OD)值，依次在24、48 h時(shí)測(cè)每組細(xì)胞的OD值。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bmal1、HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)水平

采用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用qPCR試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中Bmal1、HIF-1α、VEGF 的mRNA表達(dá)水平，按照說(shuō)明書(shū)加試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.5Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Bmal1、HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)水平

向6孔板細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，提取各組細(xì)胞總蛋白。用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)檢測(cè)蛋白水平，分別取各個(gè)蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5% 脫脂奶粉中封閉1 h。用Tris-HCl鹽加吐溫緩沖液(TBST)洗膜3次，10 min /次，加入一抗(1∶1 000稀釋)雜交，4 ℃過(guò)夜孵育。加入二抗(1∶3 000稀釋)雜交，室溫孵育1 h。曝光、顯影。用Image J軟件分析每組各個(gè)蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞Bmal1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲除組細(xì)胞Bmal1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；與放療組比較，聯(lián)合組細(xì)胞Bmal1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

1:對(duì)照組;2:敲除組;3:放療組;4:聯(lián)合組；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與放療組比較。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較

CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞OD值結(jié)果顯示，0 h各組細(xì)胞OD值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24 h后4組細(xì)胞增殖能力大小依次為：對(duì)照組細(xì)胞最強(qiáng)，其次為敲除組、放療組，增殖能力最低的為聯(lián)合組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.3 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)水平均在聯(lián)合組細(xì)胞最低，分別是對(duì)照組細(xì)胞的0.40、0.38倍，其次是放療組、敲除組，對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)水平均最高，各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，b:P<0.01，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與敲除組比較；d：P<0.05，與放療組比較。

2.4 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較

Western blot結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)水平均在對(duì)照組最高，而在聯(lián)合組表達(dá)水平最低，分別是對(duì)照組細(xì)胞的0.45、0.35倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)放療組和敲除組HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

1:對(duì)照組;2:敲除組;3:放療組;4:聯(lián)合組；a：P<0.05，b:P<0.01,與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與敲除組比較；d：P<0.05，與放療組比較。

3 討 論

隨著放射技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展，放療作為結(jié)直腸癌重要的治療手段，在一定程度上提高了患者的生存率，但是放射抵抗的出現(xiàn)，會(huì)使部分患者發(fā)生復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致治療失敗的原因之一。由此，本課題組猜測(cè)是否存在一種對(duì)正常組織細(xì)胞損害相對(duì)最小，而殺傷腫瘤效果最好的影響放療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。尋找對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生最大毒性的同時(shí)盡量避免放療抵抗的方法，可以突破放療的局限性，對(duì)增加放療敏感性具有重大意義。

2017年3位科學(xué)家因揭示了生物鐘基因調(diào)控生物體晝夜節(jié)律性的奧秘而獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。節(jié)律基因Bmal1作為晝夜節(jié)律的核心元件之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，可作為抑癌基因或促癌基因，一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究表明，早晨放療有更多的毒副作用，這與節(jié)律基因Per3突變有關(guān)[5]。但是關(guān)于Bmal1基因是否對(duì)結(jié)直腸癌放療的敏感性產(chǎn)生影響還少見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲除Bmal1基因，旨在探索Bmal1是否可以通過(guò)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性。

放療對(duì)于腫瘤患者治療的有效性取決于其破壞腫瘤細(xì)胞DNA的能力，放療抵抗性的出現(xiàn)部分原因是腫瘤細(xì)胞高效和多余的DNA修復(fù)能力[6],而DNA修復(fù)基因在mRNA和蛋白表達(dá)上有周期性的表達(dá)模式[7-8]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)節(jié)律基因Per1可以減輕膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA損傷，使腫瘤細(xì)胞更不容易受到放療導(dǎo)致的凋亡和其他損傷效應(yīng)的影響[9]。本研究通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除組、放療組與對(duì)照組細(xì)胞相比，OD值均降低，提示敲除Bmal1和放療都可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力；聯(lián)合組細(xì)胞比其他3組細(xì)胞的增殖能力都低，提示Bmal1基因可以參與放療敏感性的調(diào)控。這些結(jié)果表明，敲除Bmal1基因可以通過(guò)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力從而增加對(duì)放療的敏感性。也有研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)鼻咽癌的放療敏感性[10]，可能與P53、P21蛋白上調(diào)有關(guān)，與本研究的結(jié)果不同可能是由于腫瘤細(xì)胞的種類(lèi)和調(diào)控的分子機(jī)制不同導(dǎo)致。

一項(xiàng)大規(guī)模的癌癥生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤缺氧的標(biāo)志物HIF和VEGF，與晝夜節(jié)律失調(diào)之間存在關(guān)聯(lián)，包括晝夜節(jié)律抑癌因子的缺失或晝夜節(jié)律促癌因子的激活，HIF可以改變晝夜節(jié)律[11-12]。晝夜節(jié)律也會(huì)影響HIF-1α的缺氧反應(yīng)，此外，在HIF-1α基因的啟動(dòng)子上有一個(gè)E-box，表明Clock/Bmal1可以誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)節(jié)律基因Cry1可以直接與HIF-1α蛋白結(jié)合，從而抑制靶基因HIF-1α的表達(dá)[14]?；谝陨蠈W(xué)者的研究，本研究RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)放療處理，與對(duì)照組比較，Bmal1基因敲除后HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均降低，提示節(jié)律基因Bmal1可以調(diào)控HIF-1α/VEGF信號(hào)通路。MA等[15]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，敲除Bmal1基因可以降低HIF-1α和VEGF的表達(dá)，從而影響軟骨細(xì)胞的發(fā)育[15]。

本研究通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果顯示，無(wú)論有無(wú)敲除Bmal1基因，放療組比對(duì)照組的HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，提示HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平與放療敏感性相關(guān)，表明HIF-1α/VEGF通路可以參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌放療敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌在放療過(guò)程中，HIF-1α和VEGF可以預(yù)測(cè)宮頸癌患者放療效果及患者預(yù)后[16]；在宮頸鱗癌中放療緩解患者組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于放療未緩解患者[17]。彭明堯等[18]證實(shí)了食管鱗癌患者腫瘤組織中HIF-1α、VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與近期放療效果密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，Bmal1基因敲除聯(lián)合放療細(xì)胞的HIF-1α和VEGF表達(dá)水平比單純放療和Bmal1基因敲除細(xì)胞均降低(P<0.05)，且與對(duì)照組比較明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明敲除Bmal1基因可以通過(guò)調(diào)控HIF-1α/VEGF信號(hào)通路來(lái)增加對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞放療的敏感性。

綜上所述，本研究從細(xì)胞和分子水平上，來(lái)觀察Bmal1基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響，本研究結(jié)果顯示，節(jié)律基因Bmal1為改善結(jié)直腸癌放療效果提供了一定的理論基礎(chǔ)，但參與結(jié)直腸癌放療敏感性調(diào)節(jié)的其他可能的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。