李海強(qiáng)，蔣紅鋼，沈徐寧，周 元

(浙江省嘉興市第一醫(yī)院胃腸外科 314000)

結(jié)直腸癌是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因[1]。盡管在結(jié)直腸癌的診斷和治療方面取得了很大的進(jìn)展，但由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等原因，患者的預(yù)后仍不理想[2-3]。因此，迫切需要進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌進(jìn)展的分子機(jī)制，尋找結(jié)直腸癌新的診斷和治療靶點。長鏈非編碼RNA (lncRNAs)是一組保守性較差的內(nèi)源性RNA分子，其長度超過200 nt，且無編碼蛋白的能力[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA作為調(diào)節(jié)因子參與了各種生理和病理過程，或作為癌基因或腫瘤抑制因子參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。牛磺酸上調(diào)基因1(TUG1)是一個7.6 kb的lncRNA，由22q12染色體上的ENSG00000253352基因編碼。TUG1在不同癌癥類型中表達(dá)明顯失調(diào)。在甲狀腺乳頭狀癌中，lncRNA TUG1通過靶向miRNA-145影響甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)形成[8]。在胰腺癌中，lncRNA TUG1/EZH2軸通過海綿miRNA-382促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT表型形成[9]。在卵巢癌中，lncRNA TUG1通過miRNA-186-5p/ZEB1軸促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和干細(xì)胞增殖[10]。然而，TUG1是否能通過類似的機(jī)制調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展仍不清楚。因此，本研究中旨在探討lncRNA TUG1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其影響細(xì)胞增殖、侵襲和EMT的作用機(jī)制，為確定結(jié)直腸癌預(yù)后的有效生物標(biāo)志物和有效治療靶點提供可能依據(jù)，也為闡明結(jié)直腸癌的病理生理基礎(chǔ)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本組織

選擇本院2018年5月至2020年5月病理確診為結(jié)直腸癌并行腫瘤切除術(shù)的患者52例，男30例，女22例，年齡32～83歲，平均(58±8.13)歲。選取患者切除的新鮮癌組織及匹配的癌旁組織，將其冷凍并保存在液氮中。每例患者均獲得書面知情同意，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2細(xì)胞及試劑

結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480及其人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購自美國HyClone公司(貨號:SH30243.01B)。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及其細(xì)胞轉(zhuǎn)染

SW480及NCM460在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中保存。細(xì)胞株均在5% CO2培養(yǎng)箱，保持在37 ℃環(huán)境下生長。消化長滿的SW480細(xì)胞并鋪于6孔板，所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染均按照說明書使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)箱中放置48 h后取出收集樣品。

1.2.2SW480細(xì)胞分組

根據(jù)SW480細(xì)胞加入的siRNA NC、TUG1 siRNA、KIAA1199 siRNA序列將其分為siRNA NC組、TUG1 siRNA組、KIAA1199 siRNA組；根據(jù)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor不同將其分為inhibitor NC組和miRNA-194-5p inhibitor組；根據(jù)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics不同將其分為pcDNA-3.1++mimics NC組(A組)、pcDNA-TUG1+mimics NC組(B組)、pcDNA-3.1++miRNA-194-5p mimics組(C組)、pcDNA-TUG1+miRNA-194-5p mimics組(D組)。

1.2.3雙熒光素酶實驗分析lncRNA TUG1與miRNA-194-5p的相關(guān)性

將SW480細(xì)胞接種于24孔板(8 000個/孔)，將含有細(xì)胞周期蛋白D2(CCND2)野生型或突變3′UTR的100 ng psiCHECK2熒光素酶載體與100 nm miRNA-194-5p mimic或mimics NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，按照制造商的說明進(jìn)行雙熒光素酶報告物檢測;腎素酶信號被歸一化為螢火蟲熒光素酶信號用于每個個體的分析。所有實驗重復(fù)2次。

1.2.4CCK-8法檢測SW480細(xì)胞活力

采用CCK-8檢測SW480細(xì)胞活力。取處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以5×103個/孔的密度將其置于96孔板中。在培養(yǎng)箱中靜置2 d后，每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度(A)值，所有實驗均為3個重復(fù)。

1.2.5Transwell實驗檢測SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目

使用涂有基質(zhì)的Transwell室檢測細(xì)胞侵襲。將無血清培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞添加到Transwell室的上室中，600 μL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入下室作為化學(xué)引誘劑。孵化后48 h，下室中的細(xì)胞層用5%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min。PBS洗滌后，在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取每個樣品的5個區(qū)域，捕捉被侵襲細(xì)胞進(jìn)行計算。

1.2.6RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及其RT-qPCR檢測

使用TRIzol試劑從結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞系中提取總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計(Wilmington,USA)測量RNA的純度和濃度，按照制造商的說明使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后在ABI 7900Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,USA)下，使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Roche,Basel,Switzerland)進(jìn)行定量，GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析結(jié)果。重復(fù)3次實驗。引物如下，lncRNA TUG1上游引物：5′-CCA GAC CCT CAG TGC AAA CT-3′；下游引物：5′-CAA TCA GGA GGC ACA GGA C-3′。miRNA-194-5p上游引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGT GTA ACA GCA ACT CC-3′；下游引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′。KIAA1199 上游引物：5′-GCT TAC CCC AAG TTC ACC GA-3′；下游引物：5′-AGT GCT GCT TGG AAC TCT CC-3′。GAPDH上游引物：5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′；下游引物：5′-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3′。

1.2.7Western blot分析細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白和KIAA1199蛋白表達(dá)

(1)從結(jié)直腸癌細(xì)胞中提取蛋白，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Bio-Rad)上。將PVDF膜與5%脫脂牛奶孵育90 min，阻斷非特異性結(jié)合。(2)將PVDF膜與一抗孵育，包括抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和抗GAPDH，于4 ℃過夜孵育。用Tris-HCl鹽加Tween緩沖液(TBST)洗滌PVDF膜后，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在37 ℃下孵育。最后使用ECL-plus檢測系統(tǒng)對蛋白進(jìn)行可視化檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組組織及細(xì)胞中TUG1、miRNA-194-5p及KIAA1199的表達(dá)水平比較

與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中TUG1及KIAA1199表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，miRNA-194-5p表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與NCM460細(xì)胞比較，SW480細(xì)胞中TUG1及KIAA1199表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，miRNA-194-5p表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，見表1。

表1 各組組織及細(xì)胞中TUG1、miRNA-194-5p及其KIAA1199的表達(dá)水平比較

2.2 siRNA NC組與TUG1 siRNA組SW480細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與siRNA NC組比較，TUG1 siRNA組SW480細(xì)胞內(nèi)TUG1表達(dá)水平及細(xì)胞增殖活力明顯下降(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)；SW480細(xì)胞內(nèi)N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，見圖1、表2。

A：CCK-8檢測；B：Transwell檢測(×200)；C:Western blot檢測；a:P<0.01,與siRNA NC組比較。

表2 siRNA NC組與TUG1 siRNA組SW480細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.3 lncRNA TUG1與miRNA-194-5p的關(guān)系

生物學(xué)信息軟件miRcode預(yù)測TUG1和miRNA-194-5p之間可能的結(jié)合位點，見圖2。與TUG1 wt+mimics NC組相比，TUG1 wt+miRNA-194-5p mimics組細(xì)胞熒光素酶活性明顯下調(diào)(1.14±0.52vs.0.37±0.08，t=3.297，P=0.087)，與TUG1 mut+mimics NC組相比，TUG1 mut+miRNA-194-5p mimics組細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(1.23±0.05vs.1.26±0.12，t=1.137，P=0.36)。

圖2 檢測lncRNA TUG1與miRNA-194-5p的結(jié)合位點

2.4 inhibitor NC組與miRNA-194-5p inhibitor組SW480細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與inhibitor NC組比較，miRNA-194-5p inhibitor組SW480細(xì)胞內(nèi)miRNA-194-5p表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)，增殖活力明顯上升(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯(P<0.01)；SW480細(xì)胞內(nèi)N-cadherin、Vimentin表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖3、表3。

A：CCK-8檢測；B：Tranwell檢測(×200)；C:Western blot檢測；1:inhibitor NC組;2:miRNA-194-5p inhibitor組;a:P<0.05,與inhibitor NC組比較。

表3 inhibitor NC組與miRNA-194-5p inhibitor組SW480細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.5 4組SW480細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與A組比較，B組細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)；C組細(xì)胞增殖活力明顯下降(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)明顯下降(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與C組比較，D組細(xì)胞增殖活力明顯上升(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)明顯下降(P<0.01)，見圖4、表4。

A:CCK-8檢測;B:Transwell檢測(×200);C:Western blot檢測;a:P<0.01，與A組比較;b:P<0.01,與C組比較。

表4 4組SW480細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.6 4組SW480細(xì)胞KIAA1199表達(dá)水平比較

與A組比較，B組細(xì)胞內(nèi)KIAA1199基因和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，C組細(xì)胞內(nèi)KIAA1199基因和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與C組比較，D組細(xì)胞內(nèi)KIAA1199基因和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，見表5、圖5。

表5 4組SW480細(xì)胞KIAA1199基因及其蛋白表達(dá)水平比較

A:RT-qPCR檢測;B:Western blot檢測;a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.01,與C組比較。

2.7 siRNA NC組與KIAA1199 siRNA組SW480細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與siRNA NC組比較，KIAA1199 siRNA組SW480細(xì)胞內(nèi)KIAA1199表達(dá)水平及細(xì)胞增殖活力明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)；SW480細(xì)胞內(nèi)N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，見圖6、表6。

A：CCK-8檢測；B：Transwell檢測(×200)；C:Western blot檢測；a:P<0.05,與siRNA NC組比較。

表6 siRNA NC組與KIAA1199 siRNA組SW480細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，在我國呈快速上升趨勢。而局部和全身轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的主要原因。因此，有必要探討結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，lncRNA TUG1、miRNA-194-5p和KIAA1199在結(jié)直腸癌增殖、侵襲及EMT過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。較高水平的TUG1可直接與成熟的miRNA-194-5p結(jié)合并作為生物海綿，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。此外，TUG1可靶向miRNA-194-5p調(diào)控KIAA1199的表達(dá)。本文在TUG1/miRNA-194-5p/KIAA1199通路對結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)展的調(diào)控機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)TUG1是一種很有前途的結(jié)直腸癌治療靶點和有用的生物標(biāo)志物。

近年來，已被許多研究證實，lncRNA的異常調(diào)節(jié)參與了幾乎所有人類癌癥的發(fā)病機(jī)制，表明lncRNA可以作為致癌基因或腫瘤抑制因子在人類癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。TUG1首次被發(fā)現(xiàn)并被認(rèn)為是一種新的視網(wǎng)膜非編碼RNA，TUG1可以與生長相關(guān)基因相互作用，并在各種惡性腫瘤中作為關(guān)鍵的致癌基因發(fā)揮作用。XU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1可加重前列腺癌的進(jìn)展，預(yù)測預(yù)后不良。WANG等[12]研究表明，lncRNA TUG1通過TUG1/miRNA-145-5p/trpc6通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和遷移。本研究結(jié)果顯示，TUG1在結(jié)直腸癌中上調(diào)，并在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和EMT中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，siRNA下調(diào)TUG1在SW480細(xì)胞中的表達(dá)后，明顯抑制了SW480細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT發(fā)生，這些結(jié)果支持了TUG1沉默可有效降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生，對確定新的治療靶點，促進(jìn)結(jié)直腸癌的臨床治療具有重要意義。

TUG1被認(rèn)為通過作為ceRNA調(diào)控某些靶點(如miRNA)，在多種人類癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。TUG1作為miRNA海綿，可與miRNA-29a、miRNA-128-3p、miRNA-498等多種miRNA結(jié)合，進(jìn)一步影響這些miRNA某些靶基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[13-15]。本研究結(jié)果顯示，TUG1可靶向結(jié)合miRNA-194-5p，上調(diào)TUG1通過miRNA-194-5p可促KIAA1199表達(dá)及SW480細(xì)胞增殖、侵襲及EMT。如miRNA-194-5p通過靶向E2F3抑制膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲[16]。下調(diào)miRNA-194-5p通過改變鼠雙微體2(MDM2)的表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇耐藥[17]。miRNA-194-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞和腫瘤組織中的表達(dá)經(jīng)常降低，并發(fā)揮抑瘤作用，這與其他癌癥一致。此外，本研究數(shù)據(jù)也證實了lncRNA TUG1通過靶向miRNA-194-5p調(diào)控KIAA1199表達(dá)。有文獻(xiàn)報道KIAA1199在人類癌癥和癌細(xì)胞發(fā)展中起重要作用[18]。KIAA1199作為胃癌藥物治療新靶點具有重要的臨床意義[19]。KIAA1199通過PI3K-Akt介導(dǎo)的EMT促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移[20]。ZHAO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1199通過PP2A/stathmin通路調(diào)控的微管不穩(wěn)定促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，KIAA1199在結(jié)直腸癌中上調(diào)，KIAA1199 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，可明顯抑制SW480細(xì)胞的惡性發(fā)展。

綜上所述，TUG1在結(jié)直腸癌中明顯上調(diào)，TUG1的激活可能參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展。在結(jié)直腸癌中，TUG1通過作為miRNA海綿沉默miRNA-194-5p來調(diào)節(jié)KIAA1199，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和MET。本研究結(jié)果對于闡明TUG1/miRNA-194-5p/KIAA1199通路在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的確切作用和分子機(jī)制有促進(jìn)作用。